血管内皮细胞生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)是一种蛋白质性生长因子,能特异性作用于血管内皮细胞,促进内皮细胞增殖和迁移,同时增加血管通透性,促进新生血管生成,在创面愈合中起重要作用[1-2]。fms样酪氨酸酶(fms-liketyrosine kinase-1, flt-1)是VEGF的高亲和力受体,与血管形成有关[3]。血小板反应蛋白-1 ( thrombospondin 1,TSP-1)是广泛分布于上皮来源组织中的细胞外基质糖蛋白,是血管生成的强抑制剂[4]。本研究利用hVEGF基因工程生物膜覆盖大鼠全层皮肤缺损创面,研究在创面愈合过程中VEGF对其受体flt1和TSP-1表达的影响。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　动物:清洁级雌性SD大鼠80只,体质量200~250 g,购自上海西普尔-必凯实验动物公司,生产许可证号: SCXK(沪)2003-0002,使用许可证号:SYXK(沪)2003-0026。

1.1.2　主要试剂:兔抗人flt-1多克隆抗体(SC9029)1∶50和山羊抗人TSP-1多克隆抗体(SC12312)1∶50(Santa Cruz),山羊抗鼠/兔IgG抗体-HRP多聚体(北京中杉金桥生物技术有限公司),UltraSensitive SP超敏试剂盒(Kit-9709)(福州迈新生物技术开发有限公司)。

1.2　方法

1.2.1　建立动物模型[5]和分组:在所有SD大鼠背部制作2 cm×2 cm深达皮肤全层和肌筋膜的正方形创面。80只SD大鼠随机分为A、B、C、D四组,每组20只。A组(实验组):创面覆盖hVEGF基因工程生物膜和Tegaderm切口膜;B组:创面覆盖空白生物膜和Tegaderm切口膜,C组:创面覆盖含空质粒的成纤维细胞种植的生物膜和Tegaderm切口膜;D组:创面覆盖Tegaderm切口膜(B、C、D组设为对照组)。分别于术后3、7、14、29 d脱颈处死大鼠,并在创面处取材。

1.2.2　flt-1表达检测:用免疫组化二步法检测大鼠全层皮肤缺损创面flt-1的表达。石蜡切片脱蜡,微波抗原修复(98℃, 15 min,自然冷却),加入一抗兔抗人flt-1多克隆抗体后4℃冰箱孵育过夜;二抗为山羊抗鼠/兔IgG抗体-HRP多聚体,DAB显色,苏木精复染。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.3　TSP-1表达检测:用免疫组化SP法检测创面内TSP-1的表达。石蜡切片脱蜡、抗原修复,按SP超敏试剂盒说明,用3%H2O2消除内源性过氧化物酶的活性, 10%正常山羊血清封闭后加入一抗山羊抗人TSP-1多克隆抗体, 4℃孵育过夜;加入50μL生物素标记二抗室温孵育10min,PBS冲洗后滴加50μL链霉素抗生物素-过氧化物酶室温孵育10min,PBS冲洗、DAB显色、苏木素复染、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.4　结果判断及图像分析: flt-1在内皮细胞中表达,表现为胞质内呈棕黄色颗粒。采用Polaroid数字显微摄像,代写论文光镜10×20视野下,每张切片随机采集5个视野,使用Image J软件计数全层皮肤缺损创面中flt-1阳性细胞数。TSP-1在成纤维细胞和内皮细胞中表达,在胞质中呈淡棕黄色判断为阳性。采用Polaroid数字显微摄像,光镜10×40视野,每张切片在相同曝光时间及相同光圈下随机采集5个视野。图像分析软件选用Image-pro plus 5. 02,在标准光密度和HSI颜色系统校正后,统计图像中TSP-1阳性表达的平均光密度值和累积光密度值,以累积光密度值作为参照。

1.3　统计学处理　所得数据采用SAS 9. 0软件进行统计学分析,计量数据以x±s表示,组间比较采用t检验。P<0.05表示有统计学意义。

2　结　果

2.1　创面内flt-1的表达　A组大鼠于术后3 d时,创面内即可见flt-1在血管内皮细胞胞质内表达;术后7 d时, flt-1阳性表达的内皮细胞数量多,范围广;术后14 d时, flt-1阳性表达仍维持在高水平。术后3、7、14 d时,A组创面内flt-1阳性细胞数均高于同时相B、C、D组,且差异有统计学意义(P<0. 01);术后29 d时, A组阳性细胞数明显高于D组(P<0. 05),但与B、C组比较差异无统计学意义(P>0. 05)(表1、图1)。

2.2　创面内TSP-1的表达　A组各时相创面中TSP-1的阳性表达均弱于B、C、D组,术后7、14、29 d时差异有统计学意义(P<0. 01)(表1、图2)。3　讨　论

创伤愈合的关键步骤之一就是肉芽组织的形成,毛细血管是肉芽组织的重要组成成分,毛细血管形成的时间、数量和质量直接影响到创伤愈合的程度。

正常生理状态以及创面愈合过程中,内源性VEGF在组织中表达极低,但在多数恶性肿瘤中有高表达[6]。我们前期研究[5,7]发现,将hVEGF基因工程生物膜覆盖于大鼠创面后,各时相实验组小鼠创面中VEGF的表达显著增加,内皮细胞数和新生毛细血管数显著增多,能强有力地促进肉芽组织的形成。VEGF和TSP-1是调节血管生成的两个重要因子,在创面愈合过程中,新生毛细血管的形成与VEGF及其受体表达有关,并受TSP-1抑制血管生成效应的影响。

VEGF通过特异性地与血管内皮细胞相应的受体结合,在愈合过程中发挥生物活性作用,促进血管内皮细胞的分裂、增殖和增加血管的通透性,进而促进新生血管的形成[8]。在大鼠内皮细胞中存在的VEGF高亲和力受体为flt-1和含激酶插入区受体(kinase insertdomain containing receptor, KDR), flt-1影响新生血管的形成,在内皮细胞之间、内皮细胞和基质之间发挥作用[3];KDR主要是促进内皮细胞有丝分裂的关键介导物[9]。两者在内皮细胞的增殖、分化和血管形成过程中发挥的作用有所不同,由于flt-1主要与血管形成有关,且亲和力要高于KDR,因此选择flt-1作为本实验的研究对象。

VEGF受体一般在正常组织内表达较低,而在创伤愈合和肿瘤形成等病理过程时,受体表达会有所上调[10]。本实验结果显示,在术后3、7、14d时实验组中flt-1在内皮细胞表达呈强阳性,且阳性细胞数与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),表明VEGF可以通过激活某种flt-1表达通道而增强flt-1的表达,并且这种效应在创面愈合的早期就能显现。此外,结合前期对创面中VEGF表达的研究[7]发现,实验组创面中flt-1表达的变化和VEGF表达的变化基本一致,均在术后7、14d时创面阳性细胞数达到峰值。这种一致性的表达升高更有利于两者充分的结合而发挥其生物学效应,可以增强血管形成信号在内皮细胞的传递,进一步促进血管生成,有利于创面愈合的进程。但在术后29d时,实验组flt-1的表达与对照组C、D相比差异不显著,表明在创面愈合晚期,新生血管已趋于成熟, flt-1表达下降,可避免血管的过度增生。目前对flt-1表达的调控机制研究较少,本实验结果为VEGF能上调flt-1的表达提供了一定依据。

在创面愈合过程中TSP-1由内皮细胞和成纤维细胞等细胞分泌,是血管生成的强抑制剂,可以阻断各种促进血管生成因子引起的内皮细胞增殖、迁移和管腔形成[11-12],并通过与CD36结合产生的信号传导最终通过caspase-3样效应器诱导内皮细胞凋亡[13],从而抑制新生血管形成。通过显微镜观察创面内TSP-1的表达和对其平均光密度的测定发现,TSP-1主要在内皮细胞和成纤维细胞的胞质中表达,术后各时相的实验组创面中TSP-1的阳性表达均弱于相应对照组,术后7、14和29d时差异有统计学意义(P<0.01)。我们认为,通过基因工程膜持续释放VEGF对创面中TSP-1的表达有显著抑制作用。创面中TSP-1表达的减少,有利于内皮细胞增殖和新生血管的生成。另外,我们也注意到在创面愈合的不同时期,实验组创面中所测得的TSP-1阳性表达平均光密度值虽然低于对照组,但该数值的变化较小,表明TSP-1的表达虽然受VEGF抑制,但可能还存在其它机制,使TSP-1的表达维持在一定水平,防止内皮细胞过度增殖及新生血管的过度增生,以避免增生性瘢痕组织的形成,具体机制还有待进一步深入研究。