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FISH检测子宫颈脱落细胞hTERC基因的表达及意义
关键字:基因,表达,意义,细胞,检测,子宫,IJ,KL,GH,EF, 发布时间:2011-08-21

第30卷第4期 2010年8月 赣南医学院学报 JOURNALOFGANNANMEDICALUNIVERSITY %Z.30^幻.4 4UG.2010 FISH检测子宫颈脱落细胞hTERC基因的表达及 jk’、,。 思X 卢义生’,冼丽英1,侯智勇1,刘 军1,陈国明1,韩淑珍2,赵继红1,罗淑贞1,陈建华1 (1.东莞市人民医院;2.东莞市厚街医院,广东东莞523000) 摘要:目的:探讨人类3号染色体端粒酶(hTERC)基因在宫颈上皮内瘤变(CIN)患者的表达及临床意义。方 法:收集2008年1月至2008年lo月东莞地区100例宫颈脱落细胞标本,其中CIN患者63例、宫颈鳞癌(SCC)患 者7例、正常细胞学或炎症妇女30例,用荧光原位杂交(FISH)方法检测宫颈脱落细胞hTERC基因。结果:在 CINI、CINⅡ/Ⅲ和SCC患者宫颈脱落细胞中hTERC基因的表达率分别是15.15%、89.67%和100%。GINI、 CINⅡ/Ⅲ和SCC组与正常组比较,hTERC基因阳性率差异有显著统计学意义(P<O.001),其中,CINI与GINII/ Ⅲ比较,CINⅡ/Ⅲ与SCC比较差异有统计学意义(P<0.05)。随着病变程度增加,hTERC基因表达率增加。 hTERC基因检测CINⅡ/III的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为86.67%、92.06%、83.87%和 93.53%。CIN和SCC组病例与正常或炎症组比较,hTERC基因扩增比例增加,可观察到明确的超二倍体现象。 hTERC基因的表达水平与宫颈病变的程度关系密切。结论:hTERC基因在CIN和SCC中表达异常,随着病变程 度增加其阳性率增加,可作为宫颈病变恶性进展的监测标志。 关键词:荧光原位杂交;端粒;染色体末端转移酶;宫颈上皮内瘤变 中图分类号:R446.1l+3文献标志码:A文章编号:100l一5779(20lo)04—0533—04 Expressionofthehumantelomerasegeneinexfoliativecytesofcervix LUYi?sheng,XIANLi?ying,HOUZhi?yong。etal (DongguanPeople§Hospital,Dongguan Guangdong523018) Abstract:Objective:Toevaluatetheffigniflcanceofexpressingthehumantelomerusegene(hTERC)intheexfoliative eytesofcervixbydual—colorinterphusefluorescenceinsituhybridization(FISH).Methods:Thefluorescencesignalin thecellsWeredetectedbyusinginterphaseFISH.Wecoleeted100specimensinDongguangfromJanuary,toOctoberof 2008anddetectedtheexpressionofhTERCgeneincellsfrom63cervicalintraepthelialneoplasia(CIN),7squamouse/lr- cinomasofthecervix(SSC)and30nomalcervix orchroniceervicitis.Results:PositiveexpressionratesofthehTEHC geneinCINI、CINII/llIandSSCwere15.15%,89.67%and100%.Comparedwithcontrolcervix orclLromceonvici. tis,hTERCgenepositiveexpressioninCINandSSCweredifferentsignificantly(P<0.001).Therewas asigniflcandy differencebetweenCINIandCINI/m(P<0.05),alsobetweenCINI/ⅢandSSC。Theexpressionrateofthe hTERCgenewasincreasedwiththeseverityofthedisease.Thesensitivity、specificity、positivepredictedvalueandnega— tirepredictedvalueofhTERCgenewhichdetectedinC1NII/Ⅲwere86.67%、92.06%、83.87%and93.53%reapee- tively.Comparingwiththecontrolgroup,the rateofhTERCgeneamplificationwasincreasedinCINandSSC.Weob— selweclhyperdiploidcellinCINandSSC.Conclusion:TheincreaseofhTERCgeneexpressionintheSCCandGINsug- geststhathTERCgene眈rves as ascreeningtestmarkerforhelpingtodeterminetheprogressivepotentialofindividualle? sions. . Keywords:fluorescentinsituhybridization;telomerase;cervicalintraepithelialneoplasia 宫颈癌是女性最常见的第二位恶性肿瘤,早期 诊断和治疗能改善患者预后。大部分低度宫颈上皮 内瘤变(cervicalintraepithelialneoplasia,CIN)能自 然消退,仅少部分CINlI/Ⅲ发展到宫颈澎,而目前 宫颈癌筛查主要通过宫颈脱落细胞学检查及FIPV 检测,两者均有一定局限性。因此,有必要寻找新的 ?基金项目:卫生部科研基金课题(编号:WKJ2007—3—001) .—~533?-—— 万方数据 换页 赣南医学院学报2010年 指标来协助诊断官颈癌前病变,以提高筛查的准确 性和可预测性,以早期发现CIN向浸润性宫颈癌的 发展。人端粒酶RNA(hTERC)是人端粒酶组分之 一,有研究证实,端粒酶激活是HPV整合入宫颈细 胞后,上皮内瘤变(CIN)向宫颈癌转化的关键步 骤…。本研究通过荧光原位杂交(fluorescenceinsi. tuhybridization,FISH)法检测官颈脱落细胞学涂片 中hTERC基因,探讨hTERC基因在CIN和宫颈鳞 癌(squamouscarcinomasofthecervix,SCC)的表达 及其临床意义。 1资料和方法 1.1资料来源收集2008年1月至2008年10月 东莞地区100例患者的官颈脱落细胞标本。患者年 龄20一65岁,平均(36.5土10.4)岁,均为已婚或有 性生活妇女。依据CIN处理指南,对异常细胞学进 行高危HPV—DNA检测和阴道镜检查,并经阴道镜 取活检,常规送病理检查。 1.2涂片判断标准和分组根据TBS(thebethesda systerm)2001年阴道/宫颈细胞学诊断系统进行细 胞学诊断。按细胞学分组分为正常或炎症细胞涂片 组、ASCUS组、LsIL组和HSIL组。所有FISH检测 用涂片,经10%抽样,并由本科细胞学医师诊断,和 其细胞学涂片结果对照,符合率为100%。依据组 织学的病理结果分为正常或炎症组、CINI组、CIN Ⅱ/Ⅲ组和鳞状细胞癌(SCC)组。 1.3细胞标本采集 用薄层液基细胞学宫颈刷插 人宫颈口,在宫颈外口鳞柱状上皮交界处,以宫颈外 口为中心,均匀旋转3—5周,取出宫颈刷。 1.4制作方法用TCT低渗制片,将TCT保存液 瓶中剩余的液体(>5mL),I500r/min离心5rain, 加胶原酶B,37℃水浴20rain,再离心,加5mL去 离子水37%水浴20~40rain,生理盐水液漂洗沉 渣,重复2次;加2-5mL37%KCI低渗液重新吹打 悬浮细胞,置37℃水浴箱中孵育20min,离心、加入 5mL固定液(甲醇:冰乙酸3:1)固定10rain。离 心后弃上清,将细胞滴于玻片制片。 1.5FISH法hTERC基因检测 (1)探针:hTERC 探针由北京金菩嘉医疗科技公司提供,为hTERC/ CSP3DNA探针,hTERC基因位于3q26.3,此区域包 含人类端粒酶基因的RNA组分,模板由11个核苷 酸组成,序列57一CUAAC—CCUAAC一3hTERCDNA 探针杂交到3号染色体长臂26.3,荧光信号为红色 (四甲基罗丹明),CSP3DNA杂交到3号染色体着 .-——534...。 丝粒(3plI.1一q11.1),荧光信号为绿色(细胞绿), CSP3作为对照探针,hTERC作为检测探针;(2)涂 片预处理:涂片置于2XSSC(pH7.0)5rain×2, 0.1moVLHCI1—2rain。0.01mol/LHCL和胃蛋白 酶混合液2min,室温下l×PBS洗脱3次,70%、 85%和100%乙醇梯度脱水固定,自然干燥;(3) FISH操作步骤:避光环境中,玻片和探针混合液 (7“L杂交缓冲液、l斗L去离子水和2弘L探针),在 70%甲酰胺+2×SSC变性液中,(73±1)℃变性 5rain,用一20℃预冷的70%、85%和100%乙醇梯 度脱水3rain,玻片自然干燥,置人45—50℃烤片机 预热后与探针杂交,10肛L探针混合液滴于杂交区 域,加盖盖玻片,封片,42%保温箱过夜杂交。次日 玻片洗脱:移去盖玻片,46℃下玻片置于50%甲酰 胺+2 xSSC混合溶液,10rain×3,再置于2×SSC 溶液10rain,最后于2×SSC+0.1%NP40混合溶液 中5min。玻片干燥后加16trLDAPI复染液,放于 暗盒复染45~60rain。 1.6FISH信号的判断 (1)用OLYMPUSB×51 荧光显微镜在DAPL/FIFC/TexasRed三色滤光镜激 发下观察间期细胞荧光杂交信号,用VideoTest公司 提供的FISH分析软件分析图像,评估整个涂片的 CSP3和hTERC基因双色探针杂交情况。(2)判断 标准:选取20例正常宫颈细胞涂片,每例切片至少 分析100个检测细胞,统计正常宫颈细胞涂片上皮 细胞中出现绿:红<2:2的百分比,超过平均百分 值+3个标准差则可诊断为hTERC基因有扩增。 统计各组宫颈病例中各种异常信号细胞的百分率。 按观察到的信号数记录为CSP3信号数:hTERC信 号数,二倍体记录为2:2,hTERC异常信号的各种 类型记录为2:3,2:4,3:3,4:4及其他等。 1.7统计学处理用SPSS13.0软件进行统计学 分析,比较各级病变hTERC的表达,采用x2检验, 检验标准d=0.05。 2结果 2.1正常宫颈细胞hTERC基因杂交信号分布情况 以20例正常富颈病例作为正常对照并确立阈值, 每例样本计数100个,hTERC基因杂交信号(n)分 布情况如下:列入计数的2000个细胞中,以绿:红 荧光信号为2:2为主(90.55%),部分患者出现2 :3(6.9%)。2:4(0.7%),3:3(O.9%)。4:4 (0.25%)及其他(o.7%)类型信号。按照上述杂交 信号的结果判定方法:以正常宫颈脱落上皮中 万方数据 换页 4期 卢义生,等FISH检测子宫颈脱落细胞hTERC基因的表达及意义 hTERC基因杂交信号为标准确定,11≥3的细胞百分 值Mean=1.75SD:I.49mean4-3SD=lI.67,多体 型(n≥3)百分比上限为11.67,大于此上限者可认 为hTERC基因有扩增。 2.2CIN患者宫颈脱落细胞hTERC基因的表达 可用于分析结果的宫颈细胞学涂片共100例,其中, 正常或炎症组涂片30例,异常细胞学涂片70例,后 者包括ASCUS41例,LSIL36例,HSIL21例。细胞 学与组织学的情况,见表I。100例涂片组织学分组 hTERC基因表达见表2。正常或炎症组hTERC基 因阳性率为O%(0/30例),CINI、CINII/llI、SCC 组与正常组比较,hTERC基因阳性率有显著差异(P <0.001)。其中CINI与CINⅡ/Ⅲ,CINII/Ⅲ与 SCC差异有显著统计学意义(P<0.01),随组织学 病变程度增加,hTERC基因阳性率增加。 表l组织学各组的细胞学情况n(%) 表2组织学各组hTERC基因表达情况 纽别 正常或炎症 CINI CINII/nl SCC n 辟j性 300 335 3026 77 % 0 15.15 86.67 100 细胞学各组ASCUS、LSIL与HSIL组和正常组比 较,hTERC基因阳性率差异有显著统计学意义(P< 0.001),随细胞学病变程度增加,hTERC基因阳性 率增加,其中ASCUS与HSIL组比较,有显著统计学 意义(P<0.05),LSIL和HSIL组比较,有显著统计 学意义(P<0.05),见表3。 表3细胞学各组hTERC基因的表达 n 阳性 2 0 41 9 36 10 2l19 % O 22.O 27.78 90.48 2.3hTERC基因预测CINⅡ/Ⅲ的每吏感度和特异度 hTERC检测CINn/IlI敏感度、特异度、阳性预测 值和阴性预测值分别是86.67%、92.06%、83.87% 和93.53%。 2.4hTERC基因扩增类型CIN和SCC组病例与 正常组比较,hTERC基因异常扩增增加。正常组的 宫颈细胞中,3号染色体hTERC基因多表达为两个 杂交信号,而CIN和SCC组常可观察到明确的超二 倍体现象,扩增类型多为(CSP3:hTERC)2:3,、2 :4、3:3、4:4等类型,见图l、图2。分布情况 见表4。 表4组织学各组hTERC基因扩增类型 3讨论 3.1端粒酶与hTERC的结构和生物学特性人类 染色体端粒酶是由RNA和蛋白质组成的依赖RNA 的DNA聚合酶,能以自身携带的RNA为模板,以3’ 端粒为引物来合成端粒DNA,其功能是维持真核细 胞染色体末端端粒的长度,具有保护染色体末端波 降解以及和其他染色体连接的作用。端粒酶由人端 粒RNA亚单位(humantelomeraseRNA component, hTERC)、人端粒酶逆转录酶的蛋白亚单位(human telomerasereversetranscriptase,hTERT)和相关蛋白 l(TEPl)3个部分组成。其中hTERC为端粒酶的 主体结构,同时具有逆转录合成人端粒TTAGGG重 复序列的功能[2】,hTERT常常只在增殖的细胞中表 达。正常体细胞的端粒是随着有丝分裂次数的增加 而逐渐缩短,当端粒缩短到一定程度时,细胞停止分 裂,进入衰老期,当端粒酶活化时,端粒不再继续缩 短而保持平衡状态,使细胞无限制分裂繁殖。因此, 端粒酶的活化是细胞永生化或恶性化的重要事件。 3.2hTERC基因异常与宫颈病变的相关性在对 宫颈病变的研究中,宫颈细胞由CIN向宫颈癌转变 的过程中几乎都伴有3号染色体长臂的扩增,其中, 所涉及最重要的基因可能是人染色体端粒酶基因。 Heselmeyer—Haddad等…采用FISH三色探针检测宫 颈涂片hTERC基因,发现LSIL中hTERC基因阳性 率占7.14%,HSIL占76%,四倍体细胞数和laTERC .—一535,.一 一症~炎 ~或坶 塑脯删吼吼 万方数据 换页 赣南医学院学报2010年 基因扩增随细胞学病变的严重程度增加,认为检测 hTERC可作为预测高度病变(HSIL)的指标,随访这 些病例l一3年后,hTERC扩增病例中,CINI/Ⅱ进 展到CINⅢ者多于阴性病例,表明特异的基因组改 变是CIN发展到浸润癌所必需的Hj。2003年Ker. stin等H1采用FISH技术检测宫颈涂片中的 3q26hTERC基因,发现四体型细胞数和hTERC基囚 随细胞学病变的严重程度而增加。2008年Nancy 等¨’通过FISH分析了66例不同级别的宫颈液基 制片后发现,hTERC基因的表达在HSIL/SCC组与 正常/ASCUS组问差异有统计学意义,HSIIMSCC组 基因扩增的百分率明显高于正常/ASCUS组。我们 对100例患者进行分析发现,33例CINI中hTERC 基因扩增阳性率为15.15%,30例CINⅡ/11为 86.67%,7例SCC为100%,随着病变升级,hTREC 基囚扩增比例增加。Olaharski【61用双色荧光原位杂 交法研究ASCUS、LsIL和HSIL患者的宫颈涂片,显 示3号染色体四倍体和非整倍体发生频率增加,且 随病变进展,非整倍体发生频率增加明显,出现三倍 体的特殊类型。在本研究中,随着病变升级,hTREC 基因异常扩增增加,也可观察到明确的超二倍体现 象,同时发现,与正常宫颈相比,CIN中出现了四体 型与多体型,并随着病变进展,异倍体比例增加。由 此可见,宫颈癌和CIN常见染色体增加、缺失等非 整倍体染色体不稳定现象,hTERC基因异常的染色 体不稳定性与宫颈癌的发生关系密切,3q染色体不 稳定可能是宫颈癌前病变发展到宫颈癌的因素之 ’。一O 3.3在宫颈细胞涂片中,检测hTERC基因的意义 目前宫颈癌的早期筛查主要依靠液基细胞学检查 结果,细胞学检查是一种形态学检查,受取材、制片 质量和判读者主观因素影响较大。液基细胞学检查 提示ASCUS、LSIL较多,这些病例经阴道镜检查可 能未发现异常,但在随访的过程中病情进展迅速,甚 至很快发展成浸润性癌,这可能与病变位于子宫颈 管有关,而阴道镜不能发现14%的子宫颈管内病变 及25%~30%的微小浸润癌。而hTERC基因在宫 颈病变的早期表达,成为宫颈病变早期诊断的新靶 点,其含量随病变的发展而进行性发展,hTERC基 因检测对于子宫颈癌前病变的早期诊断和筛查具有 重要的临床价值。FISH方法操作相对简单,稳定性 较好,不需要细胞培养,可在早期发现少量病变细胞 遗传学异常。用FISH方法,在常规收集的宫颈细 .--——536-—-—— 胞中检测hTERC基因的扩增和染色体3着丝粒,使 染色体的非整倍体客观上可见,成为可用的检测方 法。HeselmeyerHaddad等p1报道FISH方法hTERC 基因检测预测CINI/Ⅱ进展到CINm的敏感性是 100%,特异性是70%,表明检测hTERC基因可作为 预测CINlI/III发展到宫颈癌的指标,可以早期发现 癌前病变发展到官颈癌的危险几率,为宫颈癌提供 了一种有用的生物遗传学监测指标。本研究 hTERC基因诊断CINII/Ⅲ的特异度和阴性预测值 较高,具有一定的临床应用价值。 综上所述,采用FISH方法检测端粒酶hTERC 基因的表达,可以早期发现发生癌变的趋势,可作为 预测宫颈病变发展到宫颈癌的生物遗传学监测指 标,并有望成为宫颈癌早期筛查方法,其在肿瘤的研 究及临床方面具有广阔的应用前景。 (本文图片见封二) 参考文献: [1]Hoselmeyer-HaddadK,JanzV,CastlePE,eta1.Detection ofgenomicamplificationofthehumantelomerasegene (TERC)incytologicspecimensas agenetictestforthe diagnosisofcervicaldysplasia[J].AmJofPmhd,2003。 163:1406—1416. [2]FengJ,FunkwD,WangSS,cta1.theRNAcomponentof telomerasc[J].Science,1995,269(7):1236—1241. [3]tteselmeyer-HaddadK,ScmmerfeldK,WhiteNM,eta1. Genomicamplificationofthehumantelomerasegene (TERC)inpapsmea昭predictsthedevelopmentofcer- dealcaner[J].AmJPathol,2005,166:1229—1238. [4]KerstinHH,ViktorJ,PhilipE,eta1.Detectionofgenomie amplificationofthehumantelomerasegene(hTERC)in eytdorespecimensas agenetictestforthediagnosisof cervicaldysplasia[J].AmericanJournalofPathology。 2003,163:1406—1416. [5]NancyP,CarawayAK,MarilynD,eta1.Gainofthe3q26 regionincervicovaginalliquid—basedpappreparationsis associatedwithsquamotmintraepitheliallesionsandsqua- mollscellcarcinoma[J].GynecologicOnedogy,2008, t10:37-42. [6]OlaharskilAJ。SoteloR,Soloma—L岫aG,eta1.Tetraploidy andchromosomalinstabilityareearlyeventsduringcervi? calcarcinogenesis[J].Carcinogenesis,2006,27:337— 343. (收稿日期:2010—06一02) 万方数据 换页

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