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乳腺癌组织中EMS1 mRNA检测的临床意义
关键字:临床,意义,检测,组织,IJ,MN,GH,EF,AB,CD, 发布时间:2011-08-20

第20卷第4期江苏大学学报(医学版) V01.20No.4 2010年7月 JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) July2010 乳腺癌组织中EMSlmRNA检测的临床意义 盛建1,徐青2,陈锦鹏2,何志贤2 (1.江苏大学附属人民医院普通外科,江苏镇江212002;2.南通大学附属医院普通外科,江苏南通226021) [摘要】目的:通过检测EMSI基因在乳腺癌组织中的表达,结合乳腺癌分子分型及各项I临床病理参数,分析 EMSImRNA表达水平在乳腺癌组织检测中的临床意义。方法:采用RT.PCR法检测94例乳腺癌及癌旁组织EMSI mRNA相对含量,以乳腺癌癌旁组织EMSImRNA的相对表达镀均值为界限,乳腺癌组织分为高表达组和低表达组; 采用ELIVISON二步法,对乳腺癌组织进行免疫组化分析并根据基因聚类分析进行分子分型;分析EMSl基因表达与 乳腺癌分子分型及各项临床病理参数的关系。结果:乳腺癌组织与癌旁组织中EMSlmRNA平均表达水平为0.578 ±0.105和0.397±0.079,高表达率为60.6%(57/94)。Basal.1ike型乳腺癌中EMSI平均表达水平最高,与其他分子 分型比较,差异有统计学意义。EMSImRNA高表达与患者年龄>150岁、绝经后和腋淋巴结转移成正相关,与肿瘤大 小、肿瘤分级和TNM分期状况无关。结论:EMSl基因可能是乳腺癌的一种新预后指标。 【关键词】乳腺癌;EMSI;逆转录-聚合酶链式反应;腋淋巴结转移 [中图分类号]R730.2;R737.9[文献标志码】A[文章编号]1671—7783(2010)04—0327—05 ExpressionandclinicalsignificanceofEMSlmRNAinbreast cancer SHENGJianl,XUQin92,CHENJin-pen92,HEZhi—xian2 (1.DepartmentofGeneralSurgery,theAffiliatedPeople’sHospitalofJiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212,002;2.DepartmentofGeneral Sugery,theAffiliatedHospital ofNantongUniversity,NantongJiangsu226021.China) [Abstract]Objective:TodetecttheexpressionofEMSlgeneinbreast cancertissues,combiningthe moleculartypeandclinicopathologicalparameterstoevaluatetheclinicalsignificanceofEMSIexpressionin breastcancer.Methods:TheexpressionofEMSlWasdetectedbyRT?PCRinsurgicalneoplasticandpara- neoplasticbreasttissuesfrom94 casesofbreastcancerpatients.TheER,PR,Her2/neu,EGFRstatusWas detectedafteroperationbyELIVISONtwo-stepimmunohistochemistrymethodandaccordingtogeneexpres- sionclusteringanalyzebreastcancermoleculartype,breastcancertissuesweredividedintoEMSlmRNA highexpressiongroupandlowexpressiongroupbased ontheaveragevalueofallparaneoplasticbreasttis? suesandthecorrelationbetweenEMSI geneexpression,themoleculartypeandclinicopatholo西calparame— tersofbreastcancerwasanalyzed.Results:TheaverageexpressionleveloftheEMSlmRNAWas0.578± 0.105and0.397±0.079inallneoplasticandparaneoplasticbreasttissues,and60.6%(57/94)ofallhe- oplastic caseswasEMSImRNAhighexpression.EMSIaverageexpressioninthebasal-likecarcinomaofthe breastwasthehighestthanthefourothermoleculartypesandhadsignificantdifference.Thehishexpres— sionofEMSlmRNAWaspositivelycorrelatedwithage≥50,postmenopausalstatus,axillarylymphnodes metastasis.TheexpressionofEMSImRNAWasindependenceoftumorsize,tumorgradeandTNMstage. Conclusion:EMSI genemaybe anewprognosisfactorofbreastcancer. [Keywords] breastcancer;EMSl;RT—PCR;axillarylymphnodesmetastasis EMSl基因是由Sehuuring等‘11于1992年通过 eDNA克隆序列分析发现的一种新的基因,与细胞 胞突形成有关,其编码蛋白为细胞皮质区肌动蛋白 结合蛋白(corticalaetinbindingprotein,Cortactin), [作者简介]盛建(1979一).男,主治医师,硕士.主要从事甲状腺、乳腺疾病的临床研究;徐青(通讯作者),教授。硕士生导师,E-mail: sj05817@126.oom 万方数据 换页 328 江苏大学学报(医学版)第20卷 能通过氨基末端结合并活化肌动蛋白相关蛋白2/3 (Arp2/3)复合物,来调节肌动蛋白的动力;而羧基 末端则在肌动蛋白多聚化中起关键作用,能显著增 强上皮细胞的运动迁移能力,与肿瘤细胞侵袭、转移 有关[2]。本实验通过RT-PCR法对94例乳腺癌组 织及癌旁组织中EMSImRNA表达情况进行研究, 结合乳腺癌分子分型及各项临床病理学检测结果, 分析EMSImRNA表达水平在乳腺癌组织中的临床 意义。 1资料与方法 1.1临床资料 94例女性乳腺癌为南通大学附属医院普外科 2007年2月至2008年1月收治的患者。年龄在24 ~87岁之间,平均年龄58.4岁,t>50岁者62例,绝 经者54例,61例肿块直径i>2em。病理分型、组织 学分级、淋巴结转移状况等均以术后病理报告为准。 患者术前均未进行化疗或放疗,其中行乳腺癌改良 根治术79例,根治术13例,扩大根治术2例。术后 病理证实腋窝淋巴结转移者给予化疗,腋窝淋巴结 转移超过3枚者加做放疗,雌激素受体(estrogen re. eeptor,ER)阳性者给予他莫昔芬口服5年,或者ER 阳性且绝经者使用第三代芳香化酶抑制剂进行内分 泌治疗。 1.2EMSlmRNA半定量检测 1.2.1标本收集及处理94例乳腺癌及癌旁组织 标本均在手术时收集,离体后切取新鲜无坏死组织 立即投入一196℃液氮速冻,lh后移至一70℃深冻 冰箱中保存备用。 1.2.2总RNA提取取100mg组织,采取Tfizol 一步法提取总RNA,将RNA溶于无RNA酶纯水中, 紫外分光光度计定量并鉴定RNA的纯度,RNA电 泳判断抽提RNA的质量。 1.2.3RT反应按照试剂盒说明进行,依次取2 斗g总RNA、OligodT(18)(0.5“g/山)1一、DEPC水 补至总体积12一,混匀后70℃孵育5min;依次加 入5×反应缓冲液4山、Rnase抑制剂(20U/p,1)1 出、10mmoL/LdNTP2山后,37℃孵育5rain;冰上 冷却后,加入M—MULV反转录酶(200U/山)l一 至20山反转录体系,于42℃孵育60min,70℃孵育 10rain,冰上冷却后,一20℃保存。 1.2.4PCR反应取20一反应体系中逆转录产 生的cDNA模板2.0一,10×PCR缓冲液5一,dNTP (10mmol/L)2山,脚酶1.5U,EMSl及GAPDH 引物(上、下游)各1一,MgCl2(25mmolfL)3山和 灭活Rnase的双蒸水补足体积至50山,于PCR扩 增仪上经94℃预变性5rain,94℃变性458,56℃退 火45s,72℃复性1min,30个循环,最后72℃延伸 10min。产品及引物由上海生工有限公司合成提 供。EMSI引物参考文献[3]:正义:5’一TCCCAATC— CAGAGACCCG-3’;反义:5’-TCCCCTGATGCCCAG- GTC-3’,扩增EMSI基因片断,共113bp。以细胞内 表达恒定的人GAPDH作为内参照。根据基因库中 GAPDHcDNA序列,由引物设计软件PrimePremier 5.0设计目的基因,扩增片段全长215bp。引物为 正义:5’-CCTTCATTGACCTCAACTACATG一3’;反义: 5’一CTYCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。 1.2.5PCR产物相对定量分析取lO仙lPCR产 物加入2斗l6×加载缓冲液,经2%琼脂糖凝胶水 平电泳,溴化乙啶染色,紫外灯下观测。存人Dol— phin-ld凝胶成像分析系统,测量电泳带的光密度 值。结果判定:PCR产物量以光密度×面积来表 达,以目的基因EMSl的PCR产物量与GAPDH产 物量的比值代表目的基因的相对表达量。以癌旁 组织EMSImRNA的相对表达量均值为界限,将癌 组织分为EMSlmRNA高表达和低表达组,计算高 表达率。 1.3ER、PR、Her2/neu、EGFR蛋白表达的检测 术后常规对乳腺癌组织进行免疫组化分析,采 用LABVISION2D全自动免疫组化染色仪,ELIVI. SON二步法进行染色,检测ER、PR、Her2/neu、EG- FR的表达。ER、PR蛋白染色颗粒位于胞核内,阳 性结果为胞核呈棕黄色或棕褐色颗粒;Her2/neu染 色颗粒位于胞膜,胞膜染色为阳性细胞;EGFR蛋白 染色颗粒位于胞质内,阳性结果为胞质内呈棕黄色 颗粒。染色半定量分级标准:每张切片选5个高倍 视野(200倍),按肿瘤阳性细胞率和着色强度分别 进行计分:①按阳性细胞百分率,O分为≤5%,1分 为6%一25%,2分为26%一50%,3分为5l%^: 75%,4分为>75%;②按着色计分:分为4个等级, 0分为无着色,1分为淡黄色,2分为黄色,3分为棕 黄色。两者的乘积:O分为(一),1—4分为(+), 5—8分为(++),9—12分为(+++)。统计时, (一)及(+)表达作为阴性组;(++)及(+++)表 达作为阳性组。 1.4统计学方法 使用SPSSl3.0统计软件进行统计分析。计数 资料采用Pearson卡方检验,卡方检验有相关性的, 万方数据 换页 第4期盛建,等.乳腺癌组织中EMSImRNA检测的临床意义329 行Spearman等级相关分析。方差齐性及多样本均 数比较采用F检验,数据用i±s表示。检验水准为 0.05。 2结果 2.I乳腺癌和配对癌旁正常组织中EMSImRNA 的表达水平 乳腺癌及配对癌旁正常组织均表达EMSI,服 从正态分布,且方差齐。94例乳腺癌组织中,EMSI mRNA表达的相对光密度值为0.578±0.105;癌旁 组织为0.397-1-0.079。乳腺癌组织EMSImRNA表 达均值明显高于癌旁组织,两者比较差异有统计学 意义(P<0.01)。但由于癌组织与癌旁组织EMSI mRNA表达的相对光密度值范围部分重叠,少数癌 组织EMSImRNA相对光密度值可略低于癌旁组 织,如33号标本(图l,T表示肿瘤组织,N为其癌旁 正常对照)。以EMSlmRNA表达均值0.397为界。 将乳腺癌组织EMSImRNA表达分为高表达和低表 达,本组94例乳腺癌患者中有57例患者高表达,高 表达率为60.6%(图2,T19/T27/T52/T68为高表 达,T1I/T44/T75为低表达)。 M:标准参照物;T:肿瘤组织;N:瘤旁组织 图1乳腺癌及配对癌旁正常组织中EMSImRNA表达 rigl EMSImRNAexpressionlevelsinbreastcancer andpairednormaltissues M:标准参照物;T:肿瘤组织 图2乳腺癌组织中EMSImRNA表达 rig2EMSImRNAexpressionlevelsinbreastain.t 2.2 EMSImRNA表达与乳腺癌临床病理参数的 关系 EMSImRNA高表达与年龄>150岁、绝经后、腋 淋巴结转移成正相关,相关度R分别为0.248, 0.275和0.213;而与肿瘤大小、分级水平、TNM分期 无关(表1)。 表l EMSImRNA表达与乳腺癌临床病理参数的关系 Tabl Relationshipbetw∞nEMSlmRNAexpression andelincopathologicalfeatures 凳篡群3757,…(例)(例) a:Pearson卡方检验.b:Spearman等级相关分析 2.3 EMSImRNA表达与乳腺癌分子分型的关系 免疫组化结果见图3。根据免疫组化结果,运 用Perou等一。和Sorlie等[51提出的基因表达聚类分 析,将94例乳腺癌组织按分子分型分为5种不同的 亚型:luminalA型,luminalB型,HER2过表达型, basal-like型和normalbreast—like型。分别检测 EMSl表达水平(表2)。LuminalA型中EMSI平均 表达水平最低,而basal.1ike型中EMSl平均表达水 平最高;两者EMSI平均表达水平与其余4型比较, 差异均有统计学意义(P<0.05)。 3讨论 EMSl/Cortactin促进肿瘤转移的具体作用机 制,目前尚不十分清楚。Kurebayashi等。6o发现,Cot- tactin通过加强与内皮细胞的相互作用,促进肿瘤细 胞骨转移,可能是Cortactin促进肿瘤细胞侵袭转移 的机制之一。有研究表明,Cortactin过表达通过促进 E—selectin介导的细胞间黏附连接的形成和细胞骨架 万方数据 换页 330 江苏大学学报(医学版)第20卷 图3免疫组化阴性及阳性结果(ELIVISON法,X400) Fig3 Immunohistochemicalnegativeandpositiveresults(ELIVISONmethod,x400) 表2EMSImRNA表达与乳腺癌分子分型的关系 Tab2 RelationshipbetweenEMSlmRNAexpressionandthemoleculartype a:与luminalA型比较;b:与basal-like型比较 的重组,可能是Cortactin促进肿瘤细胞侵袭与转移 的机制之一"J。EMSl/Cortactin过表达通过细胞外 信号调节激酶和/或AKT(蛋白激酶B),提高血清 和表皮生长因子介导的细胞增殖,并抑制肿瘤细胞 的失巢凋亡18】。Luo等一1研究发现,EMSl/Cortactin 可能通过P13Kinase/Akt信号途径抑制肿瘤细胞的 失巢凋亡。 腋淋巴结转移是判断乳腺癌患者预后重要的指 标,同时也是肿瘤分期及选择治疗方案的重要依据, 乳腺癌患者生存率随着阳性淋巴结数目的增多而递 减。10‘11]。本次研究我们发现,EMSl基因高表达与 乳腺癌患者年龄≥50岁、绝经后、腋淋巴结转移正 相关。提示在年龄>150岁和(或)绝经后的乳腺癌 患者中,腋淋巴结转移可能与EMSI基因高表达有 关。因此,测定EMSl表达状况对判断乳腺癌患者 的治疗方式的选择及预后判断可能有指导意义。 乳腺癌的分子分型能很好地反映其生物学行 为,明确其个体分子特征,不仅有助于判断预后, 还有助于预测乳腺癌对临床治疗的反应,是实现个 体化治疗的基础。采用基因芯片技术对乳腺癌进行 基因表达谱分析是鉴定各种分子亚型最有效的工 具。但该技术对标本的要求较高,且费用昂贵,实 际操作困难,较难在临床广泛应用;乳腺癌各分子 亚型均有蛋白质标志物如ER,PR,HER-2,CKS/ 6,EGFR等的明显差异,所以大多数研究应用免疫 组织化学技术替代基因芯片技术在蛋白质水平上对 乳腺癌进行分子分型。虽然乳腺癌的异质性使得免 疫组织化学技术的分子分型和基因芯片技术的结果 不完全一致,但前者也基本反映了各分子亚型的临 床特征,目前被广泛采用。通过对EMSI在本组乳 腺癌各分子分型中表达状况的检测,我们发现,lu. minalA型中EMSl平均表达水平最低;而basal.1ike 型中EMSI平均表达水平最高,较其他分子分型有 显著差异,提示在basal—like型乳腺癌中,EMSl高表 达可能是促进该型肿瘤早期复发转移的重要因素 之一。 合理使用分子靶向药物能显著提高乳腺癌各亚 型的治疗效果。luminalA型HER2一,内分泌治疗 效果明显优于luminalB型,但对化疗不敏感。Iu— minalB型HER2+,对他莫昔芬耐药,但对芳香化 酶抑制剂敏感。HER2过表达型ER-且PR.,故内分 泌治疗效果差;但含有蒽环类的化疗方案以及抗 HER2的靶向治疗药物赫赛汀的应用可以显著改善 其预后¨2。¨1。Normalbreastlike型对化疗最不敏 万方数据 换页 第4期盛建,等.乳腺癌组织中EMSImRNA检测的I|;}i床意义 33l 感,basallike型乳腺癌ER,PR和HER2均为阴性, 内分泌治疗和赫赛汀对其均无效。此型虽然对化疗 有较高的敏感性,但在所有分子亚型中其预后仍是 最差的,其靶向基因仍不明确,因此寻找新的靶向药 物是治疗此型患者的关键。 研究发现,ADP核糖基化因子(Arf6)在乳腺癌 的侵袭中起关键的作用。AMAPl蛋白是GTP-Arf6 的效应分子,它的表达与浸润性乳腺癌高度相关。 AMAPl与Cortactin、桩蛋白结合形成三聚体复合物 而发挥作用。在复合物中,AMAPl通过Cortactin的 脯氨酸富集区与其SH3区呈1:2结合。进一步的 研究发现,从AMAPI中衍生出的一种细胞渗透性 多肽能特异性阻抑Cortactin与AMAPI结合,从而 有效地抑制了乳腺癌细胞的浸润与转移。同时还发 现,抑制Cortactin的SH3区与脯氨酸富集区结合的 抑制剂UCSl5A,能有效阻抑Cortactin与AMAPl结 合,从而抑制乳腺癌细胞的浸润与转移。结合超微 结构分析,正常乳腺上皮细胞未发现Cortactin/ AMAPl复合物。Cortactin的SH3区很可能是乳腺 癌药物治疗的靶位点|1引。因此,我们认为,针对 CortactinSH3区的单克隆抗体对于内分泌治疗及赫 赛汀治疗效果不佳的乳腺癌患者,尤其是basallike 型乳腺癌,可能是一条新的治疗途径。 恶性肿瘤的发生、发展、浸润与转移是多基因多 因素共同作用的结果,对肿瘤相关基因的研究有利 于阐明其发生、发展及浸润转移的机制,同时为临床 早期诊断、综合治疗及预后判断提供依据。目前,对 于EMSl/Cortactin的结构、作用以及分子生物学机 制尚未完全阐明,需要进一步的研究与完善;其对于 临床的诊断、治疗及预后判断,尚需要进一步的大样 本量统计分析。 [参考文献] [2] [3] SehuuringE,VerhoevenE,MooiWJ,eta1.Identifica- tionandcloningoftwooverexpressedgenes,U21B31/ PRADlandEMS!,withintheamplifiedchromosome 1lq13regioninhumancarcinomas[J].Oncogene, 1992.7(2):355—361. 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