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兔DCM造模及骨髓间充质干细胞培养方法学的研究
关键字:方法,研究,培养,干细胞,yz,AB,CD,wx,uv,op 发布时间:2011-08-19

基金项目: 哈尔滨市科技创新人才(优秀学科带头人)研究专项资金 No.2006RFXXS030教育部黑龙江省部共建心肌缺血机理 与诊疗技术重点实验室 倡通讯作者 文章编号:1007-4287(2010)10-1539-04 兔DCM造模及骨髓间充质干细胞培养方法学的研究 孙 敏,姜双全,田家玮 倡 ,王旭东,何 宁 (哈尔滨医科大学附属第二医院超声医学科,黑龙江哈尔滨150086) 摘要:目的 探讨应用阿霉素制备兔扩张型心肌病(DCM)模型及兔骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养方法,旨 在为研究DCM治疗方法的选择以及临床疗效的观察奠定基础,为细胞移植的准备提供方法学依据。方法 应用1周 1次每次2mg/kg,及每周2次每次1mg/kg,均连续8周的给药方式进行兔DCM模型的制备,给药结束后3周处死动 物,行心肌组织病理学检查比较其效果;分别应用密度梯度离心法及全骨髓培养法进行兔MSCs的体外分离培养,比 较其生物学特性。结果 心肌组织病理学检查结果显示,两组动物心肌均呈DCM样改变,模型制备效果一致,动物死 亡率和体重减轻率无统计学差异。应用密度梯度离心法和全骨髓培养法均可获得MSCs,但所获细胞纯度及其生物学 特性略有差异。结论 本研究表明兔作为实验动物经济有效,两种给药方式模型制备效果一致,推荐使用1周1次的 给药方式;两种培养方法均可获得MSCs细胞,可根据不同实验中具体需要的细胞数量和细胞纯度进行不同培养方法 的选择。 关键词:扩张型心肌病;动物模型;骨髓间充质干细胞;体外培养;兔 中图分类号:R542.2文献标识码:A Methodologyofprepairingthedilatedcardiomyopathymodleinrabbitsandculturingthemesenchymalstemcellsisolated frombonemarrowofrabbit SUNMin,JIANGShuang-quan,TIANJia-wei,etal.(DepartmentofUltrosound,TheSecondAffili- atedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150086,China) Abstract:Objective EstablishAdriamycin-induceddilatedcardiomyopathy(DCM)modleofrabbitsthroughear-bordervein andexplorethesuitablecultureconditionofrabbitmesenchymalstemcells(MSCs)forresearchingthecell-transplantationtherapyof DCM.Methods EstablishtheDCMmodlebytwowaysofadminister.Onewayisinjectingadriamycin2mg/kgbodywtonceper weekfor8weeks,andtheotherisinjectingadriamycin1mg/kgbodywttwiceaweekfor8weeks.Wecomparetheefficiencyoftwo methodsbypathologyresultafter3weeks.ThewholemedulloculturemethodandFicoll-Hypaquedensitygradientsolutionmethodwere usedtoisolateMSCs,andthenobservingthegrowthproperty.Results After3weeksoffinalinjection,thehistomorphologychangesof myocardiumcoincidedwiththecharacteristicsofDCM.Twowaysofadministeringhadthesameefficiency.Bythewholemedullocul- turemethod,cellnumberwegotwasgreaterthanthatthroughtheFicoll-Hypaquedensitygradientsolutionmethod,butthePuritywas worse.Conclusion TheDCMrabbitmodelwhichpreparedbytwowaysofadministeringwassimilartothehistopathologychangesof DCMinhumanandwesuggestthewayofadministeringbyonceaweek.WecanchoosethemethodofculturingtheMSCsbydifferent demandsofcellnumberandcellpurityindifferentexperiments. Keywords:dilatedcardiomyopathy;animalmodel;mesenchymalstemcell;culture;rabbit (ChinJLabDiagn,2010,14:1539) 扩张型心肌病(dilatedcardiomyopathy,DCM)是 心肌病变伴心功能障碍的一组疾病,动物模型制备 对于治疗方法的选择以及临床疗效观察有着十分重 要的意义 [1,2]。 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)是存在于骨髓中的一种非造血干细 胞,具有强大的分化潜能,还可以进行跨胚层分化。 研究表明MSCs取材相对容易,体外培养扩增迅速, 异体移植无免疫排斥反应,已成为一种理想的细胞 工程学种子细胞。 1 材料与方法 1.1 研究对象 健康纯种日本大耳白兔50只(购自哈尔滨医科 大学附属第二医院动物实验中心),雌雄不限,体质 量2.00kg-2.25kg,平均(2.03±0.25)kg,随机分 为3组,A组20只,B组20只,对照组10只,各组动 物年龄体质量均无显著性差异。 1.2 兔扩张型心肌病模型的制备 将注射用盐酸阿霉素(多柔比星)用生理盐水稀 —9351—皛  中国实验诊断学 2010年10月 第14卷 第10期 换页 释成0.5mg/ml。A组,耳缘静脉注射盐酸阿霉素, 每周1次,每次2mg/kg;B组,耳缘静脉注射盐酸阿 霉素,每周2次,每次1mg/kg;对照组,注射等量生 理盐水,均连续8周。A组和B组两组注射盐酸阿 霉素的总量相同,均为16mg/kg。为避免阿霉素对 心脏急性中毒作用的干扰,两组动物均于用药结束 后3周处死,取心肌行病理学检查。 1.3 兔MSCs体外培养 1.3.1 密度梯度离心法 选取2月-2.5月龄大耳 白兔,体质量1.75kg-2.0kg,耳缘静脉注射戊巴比 妥钠麻醉,于无菌条件下使用注射器抽取5ml肝素 生理盐水混合液,然后抽取兔双侧股骨骨髓共15 ml。将20ml肝素骨髓混合液平均分成4份注入离 心管,铺于等量密度为1.077的淋巴细胞分离液上, 天平配平,2000r/min离心20min;液体分成4层, 吸取第2层乳白微透明液体层(包括其中粉红色絮 状物)平均置入两个离心管中,加入PBS定容至10 ml,2000r/min离心5min;弃上清液再次加入PBS 定容至10ml,吸管吹打混匀,再次离心5min;弃上 清液,离心管底部白色细胞层即为MSCs。加入 DMEM/胎牛血清培养基(3-5ml),混匀细胞后吸入 培养瓶置入孵箱(温度37℃,饱和湿度5%CO2)培 养。首次72h换液,以后每48h换液一次,操作中严 格无菌。首次换液时加入PBS冲洗2-3次,以后每 次换液均用PBS冲洗1-2次。待培养瓶中80%左 右细胞贴壁后即可传代。首先吸出培养瓶中培养 液,加入PBS洗去残留的培养液后吸出;然后加入 0.25%胰酶,显微镜下观察,待细胞的长梭形结构变 圆、变亮后立即弃掉胰酶加入培养液终止消化;最后 吸取培养瓶中培养液,借助冲击力吹打瓶底贴壁细 胞令其自瓶壁脱落,将细胞悬液平均置入两个培养 瓶即可 [3]。 1.3.2 全骨髓培养法 选取1月龄大耳白兔,体质 量约为0.75kg-1.0kg,由于动物体重较小,可使用 水合氯醛腹腔注射麻醉,方法简单易行,且较戊巴比 妥钠安全。无菌条件下逐层切开分离出兔双侧股 骨,注意保持股骨干净完整。将分离出的两段股骨 放入培养皿中加入75%酒精浸泡,5分钟后移入另 一无菌培养皿中,剪去两端干骺端暴露骨髓腔,注射 器抽取10mlDMEM/胎牛血清培养基冲洗骨髓腔,并 将冲下的骨髓和培养基混匀。将培养基和骨髓的混 合物平均置入两个培养瓶,孵箱中培养。首次48h 半量换液,即吸出原瓶内1/2的培养液,加入等量新 鲜培养液。再过48h后全量换液,操作中严格遵循 无菌原则。传代方式同前。 2 结果 2.1 动物的一般情况 A组首次注药后动物死亡1只,后于第5周至 第9周每周死亡1只,共存活动物14只,死亡率为 30%,体重减轻25%;B组,分别于第4周、5周、7周 各死亡1只,第8周死亡2只,共存活动物15只,死 亡率为25%,体重减轻27%;对照组于整个试验过 程中无动物死亡,且体重增加13%。A组和B组动 物均出现掉毛,食欲减退,耳部感染,精神萎靡等情 况,对照组上述情况均无。A组与B组死亡率及体 重减轻率比较无统计学意义(P<0.05)。 2.2 组织形态学观察 给药结束后3周处死动物取其心脏,甲醛固定 HE染色。可见A、B组心肌细胞呈广泛水肿和空泡 变性的改变,很多部分可见心肌脂肪变性或坏死,细 胞间质水肿,细胞间隙增宽,并可见少量炎性细胞浸 润。对照组心肌细胞排列整齐,细胞间隙不宽,细胞 间质丰富且均匀,见图 1。 注:图左为对照组兔心肌切片,右图为模型组兔心肌组织切片 图1 心肌病理组织图(HE×400) 2.3 细胞培养的一般情况 2.3.1 密度梯度离心法 首次换液后可以去除绝 大部分不贴壁的杂质细胞,只有少量悬浮的圆形杂 质细胞,可见呈螺旋状、放射状集落生长的梭形或纺 锤形的MSCs。根据细胞生长情况决定传代时机。 传代至第5代以后,细胞逐渐变得宽大畸形,增殖活 性亦减退,尤其当细胞浓度减低过多时更容易出现 细胞形态的改变。 2.3.2 全骨髓培养法 首次半量换液后可见瓶内 大量杂质细胞,培养液混浊。48h全量换液后仍有 较多杂质细胞,镜下可见大量圆形悬浮细胞和杂质 团,也有大量的旋涡状集落生长的纺锤形MSCs。一 —0451—皛  ChinJLabDiagn,October,2010,Vol14,No.10 换页 艇澍鬟, 般于第2次换液后2日即可传代。随着换液次数增 多杂质细胞逐渐减少,最终可获得较纯净的MSCs。 此法选用1月龄左右的日本大耳白兔,MSCs数量多 且生发能力较强,见图 2。 注:图左为密度梯度离心法首次换液后细胞状态,图右为全骨 髓培养法首次换液后细胞状态 图2 首次换液后细胞状态 3 讨论 扩张型心肌病是当前严重威胁人类健康的主要 心血管疾病之一,DCM动物模型是研究治疗方法和 观察疗效的重要工具 [4-5] 。本研究结果表明兔作为 实验动物经济有效,经病理证实DCM模型确切。 MSCs在损伤组织的修复,尤其是不可再生细胞组织 的修复中起到了重要作用,细胞的数量和质量是基 础。 3.1 两种造模方法的比较 在进行DCM模型的制备过程中,分别采用了文 献介绍的两种造模方法,即A组每周给药1次每次 2mg/kg,B组每周给药2次每次1mg/kg,均持续8 周,总剂量一致。比较两种给药方式后,发现两组动 物死亡率和体重减轻率无统计学意义,且动物的一 般状况也无明显差异。A组于首次注药后有1只动 物死亡而B组无动物死亡,主要考虑与动物的个体 差异、急性过敏反应或气体栓塞有关,而与给药剂量 无关,因为无论是1mg/kg还是2mg/kg均为不会致 死的小剂量。两组动物的心肌病理均呈DCM样改 变,无明显差别。考虑到阿霉素对给药局部血管和 皮肤的损害作用,减少给药时对动物造成的刺激影 响,推荐采用每周1次,每次2mg/kg的给药方式。 3.2 两种细胞培养方法的比较 目前对MSCs体外纯化扩增的方法包括密度梯 度离心法,全骨髓培养法(又称直接贴壁筛选法),流 式细胞分离法,免疫磁性分离法 [6-7]。 虽然流式细 胞分离法和免疫磁性分离法分离特异性较高,但由 于所需骨髓量较大,且仪器昂贵费用较高,本研究采 用密度梯度离心法和全骨髓培养法进行MSCs的体 外扩增。密度梯度离心法利用细胞密度不同的沉降 原理,用淋巴细胞分离液将红细胞、白细胞和间充质 细胞有效的分离开,通过1-2次换液后即可获得纯 度较高的MSCs,且视野清晰观察方便。但此法所需 骨髓量较全骨髓培养法大,操作步骤相对复杂,损失 细胞相对较多,最终获得的细胞虽纯度较高但数量 相对较少。全骨髓培养法利用血液中三系细胞均不 贴壁生长只有MSCs贴壁生长的特性,通过数次换 液除去不贴壁的杂质细胞,故又称直接贴壁筛选法。 此法操作简单,最初存在于培养液中的杂质细胞对 MSCs的生长无明显抑制,所得细胞数量较多,缩短 了原代的生长周期。但此法需经多次换液后方可去 除杂质细胞,由于红细胞沉积粘附于培养瓶底壁清 除困难,用吸管吹打清除的过程中可能损失部分尚 未牢固贴壁的MSCs。且由于漂浮的杂质细胞数量 较多,培养液混浊,视野不够清晰,为观察造成了一 定困难。首次半量换液就是希望可在早期去除部分 红细胞,以减少在底壁的沉积粘着;同时由于杂质细 胞较多、细胞数量大,及时更换部分培养液可以保证 MSCs的营养供应。两种方法最终均可获得MSCs, 可根据不同实验中具体需要的细胞数量和细胞纯度 进行选择。 体外培养MSCs易受血清浓度、贴壁时间、种植 密度、培养温度等多种因素影响,尤其是传代时的种 植密度直接影响了细胞的形态和增殖能力。接种密 度低会造成细胞生长缓慢变得宽大畸形,失去原有 的长梭形细胞形态;接种密度高细胞堆积生长,造成 接触抑制,观察时可见细胞界限不清。文献报道多 采用1∶2的比例进行传代,即1瓶平均分为2瓶,本 实验中多采用1∶1.5的比例进行传代,即1瓶分为1 瓶半或2瓶分为3瓶,以保证较高的细胞密度,细胞 分泌的细胞生长因子量多,确保获得形态标准、增殖 能力较强的细胞。 结论,反复多次小剂量耳缘静脉注射阿霉素的 累积心肌毒性作用,可以成功制备兔DCM模型;应 用密度梯度离心法和全骨髓培养法均可获得MSCs, 为研究MSCs的进一步应用奠定基础。 作者简介:孙敏(1982-),女,硕士研究生,研究方向为心血 管疾病的超声诊断。 参考文献: [1]9RecchiaFA,LionettiV.AnimalModelsofDilatedCardiomyopathyfor —1451—皛  中国实验诊断学 2010年10月 第14卷 第10期 换页 TranslationResearch[J].VeterinaryResearchCommunications,2007,31 (Suppl.1):35. [2]金 波,施海明,朱 军,等.兔扩张型心肌病模型的实验研究 [J].实验动物与比较医学,2007,27(2):77. [3]裴瑛波.骨髓间充质干细胞分离培养和定向分化的研究现状[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2009,13(14):2775. [4]YasuhiroIkeda,JohnRoss.Modelsofdilatedcardiomyopathyinthemouse andthehamster[J].Moleculargenetics,2000,15:197. [5]礼广森,任卫东,张 卓,等.阿霉素致兔早期心脏毒性模型的建 立及超声评价[J].中国医学影像技术,2006,22(4):548. [6]李艳菊,李 宁,胡亮杉,等.大鼠骨髓间充质干细胞体外培养方 法的改进[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(1):71. [7]王佳南,张晓刚,汤为学,等.大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养 条件[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(14):2740. (收稿日期:2009-12-14) 文章编号:1007-4287(2010)10-1542-03 结核分枝杆菌km基因的突变情况分析 王金河 1 ,孙海林 2 ,李洪敏 1 ,梁建琴 1 ,冯士生 1 (1畅解放军309医院结研所结核二科,北京100091;2畅鄂尔多斯二院结核科) 摘要:目的 探讨结核分枝杆菌km基因突变的情况。方法 通过传统梯度药敏试验和聚合酶链反应-单链构象 多态性(PCR-SSCP)分析248株分枝杆菌临床分离株耐药情况和km基因的变化。结果 药敏试验耐药率为32.7% (81/248),248株分枝杆菌临床分离株的16SrDNASSCP电泳图谱均与结核分枝杆菌标准株相同。81株耐卡那霉素分 离株中,24株(29.6%)km基因SSCP泳动异常。结论 其部分耐药原因可能是由于T.M耐KM药物的km基因突变所 致。 关键词:结核分枝杆菌;卡那霉素;km基因 中图分类号:R378.91 + 1文献标识码:A TheresearchoftherelatonshipbetweenKmgenemutationandthedrug-resistanceofM.tuberculosis WANGJin-he, SUNHai-lin,LIHong-min,etal.(TuberculosisResearchInstitute,309thHospitalofPLA,Beijing100091,China) Abstract:Objective TostudytherelationshipbetweenKmgenemutationandthedrug-resistantM.tuberculosis.Methods  Kanamycindrug-resistanceandKmgenemutationin248M.tuberculosisstrainsisolatedfromclinicalsputumspecimenswereanalyzed bytraditionaldrugsusceptibilitytestsandPCR-SSCP.Results Therateofdrugsusceptibilitytestswas32.7%(81/248).Theelec- trophoresisprofilesof16SrDNAPCR-SSCPindicatedthatthe248M.tuberculosisstrainswereaccordingtoM.TBstandardstrain.24 ofthe81kanamycindrug-resistantstrains(29.6%)displayedabnormalinPCR-SSCPprofiles.Conclusion Insomedegree,Kmgene mutationmaderesistancetokanamycinofM.tuberculosisstrains. Keywords:M.tuberculosis,kanamycin,Kmgene (ChinJLabDiagn,2010,14:1542) 当前,在治疗MDR-TB的抗结核一线药物大部 分已经耐药 [1-4], 人们开始把目光转向二线药物的 应用。其中,使用比较多的药物是卡那霉素(KM)。 现在常规药物敏感试验发现,临床亦出现KM耐药 的现象。传统的结核菌药敏试验能初步反映结核分 枝杆菌耐KM的表面现象,但不能分析结核分枝杆 菌是否发生本质(km基因突变)的变化。本文运用 分子生物学方法,分析248株结核分枝杆菌临床分 离株的药敏和km基因突变情况,研究KM耐药水平 和km基因之间的关系,寻找其内在的联系。 1 材料与方法 1.1 菌种和菌株来源 结核分枝杆菌标准株来源 于中国药品生物制品检定所;248株结核分枝杆菌临 床分离株来源于本院2006-2007结核科住院病人 临床标本。 1.2 分枝杆菌培养、菌种鉴定和药敏试验 按“结 核病诊断细菌学检验规程”进行分枝杆菌BACTEC培 养、菌种鉴定和药敏试验。耐卡那霉素药物浓度标 准:100μg/ml、10μg/ml和1μg/ml分别为高度、中、 低度耐药 [5-7]。 1.3 细菌DNA的制备 采用本室自制的标本前处 理试剂盒提取DNA,即:取标本0.5~1ml,加入等体 积的1XTris.Hcl-EDTA液,加入消化液50μl,混均至 80℃水水浴30分钟,每5分钟混均1次,8000rpm 10分钟,取上清1ml。向样本内加入1ml平衡酚, 颠倒混匀数次,勿振荡,8000rpm10分钟,取上层水 —2451—皛  ChinJLabDiagn,October,2010,Vol14,No.10 换页

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