| 兔DCM造模及骨髓间充质干细胞培养方法学的研究 | | 关键字：方法,研究,培养,干细胞,yz,AB,CD,wx,uv,op 发布时间：2011-08-19 |
基金项目： 哈尔滨市科技创新人才（优秀学科带头人）研究专项资金
Ｎｏ．２００６ＲＦＸＸＳ０３０教育部黑龙江省部共建心肌缺血机理
与诊疗技术重点实验室
倡通讯作者
文章编号：１００７－４２８７（２０１０）１０－１５３９－０４
兔ＤＣＭ造模及骨髓间充质干细胞培养方法学的研究
孙 敏，姜双全，田家玮
倡
，王旭东，何 宁
（哈尔滨医科大学附属第二医院超声医学科，黑龙江哈尔滨１５００８６）
摘要：目的 探讨应用阿霉素制备兔扩张型心肌病（ＤＣＭ）模型及兔骨髓间充质干细胞（ＭＳＣｓ）的分离培养方法，旨
在为研究ＤＣＭ治疗方法的选择以及临床疗效的观察奠定基础，为细胞移植的准备提供方法学依据。方法 应用１周
１次每次２ｍｇ／ｋｇ，及每周２次每次１ｍｇ／ｋｇ，均连续８周的给药方式进行兔ＤＣＭ模型的制备，给药结束后３周处死动
物，行心肌组织病理学检查比较其效果；分别应用密度梯度离心法及全骨髓培养法进行兔ＭＳＣｓ的体外分离培养，比
较其生物学特性。结果 心肌组织病理学检查结果显示，两组动物心肌均呈ＤＣＭ样改变，模型制备效果一致，动物死
亡率和体重减轻率无统计学差异。应用密度梯度离心法和全骨髓培养法均可获得ＭＳＣｓ，但所获细胞纯度及其生物学
特性略有差异。结论 本研究表明兔作为实验动物经济有效，两种给药方式模型制备效果一致，推荐使用１周１次的
给药方式；两种培养方法均可获得ＭＳＣｓ细胞，可根据不同实验中具体需要的细胞数量和细胞纯度进行不同培养方法
的选择。
关键词：扩张型心肌病；动物模型；骨髓间充质干细胞；体外培养；兔
中图分类号：Ｒ５４２．２文献标识码：Ａ
Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙｏｆｐｒｅｐａｉｒｉｎｇｔｈｅｄｉｌａｔｅｄｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙｍｏｄｌｅｉｎｒａｂｂｉｔｓａｎｄｃｕｌｔｕｒｉｎｇｔｈｅｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｓｏｌａｔｅｄ
ｆｒｏｍｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｏｆｒａｂｂｉｔ ＳＵＮＭｉｎ，ＪＩＡＮＧＳｈｕａｎｇ－ｑｕａｎ，ＴＩＡＮＪｉａ－ｗｅｉ，ｅｔａｌ．（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＵｌｔｒｏｓｏｕｎｄ，ＴｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉ－
ａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＨａｒｂｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００８６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＥｓｔａｂｌｉｓｈＡｄｒｉａｍｙｃｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄｄｉｌａｔｅｄｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ（ＤＣＭ）ｍｏｄｌｅｏｆｒａｂｂｉｔｓｔｈｒｏｕｇｈｅａｒ－ｂｏｒｄｅｒｖｅｉｎ
ａｎｄｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｓｕｉｔａｂｌｅｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｒａｂｂｉｔｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ＭＳＣｓ）ｆｏｒｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇｔｈｅｃｅｌｌ－ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｔｈｅｒａｐｙｏｆ
ＤＣＭ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＥｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅＤＣＭｍｏｄｌｅｂｙｔｗｏｗａｙｓｏｆａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ．Ｏｎｅｗａｙｉｓｉｎｊｅｃｔｉｎｇａｄｒｉａｍｙｃｉｎ２ｍｇ／ｋｇｂｏｄｙｗｔｏｎｃｅｐｅｒ
ｗｅｅｋｆｏｒ８ｗｅｅｋｓ，ａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒｉｓｉｎｊｅｃｔｉｎｇａｄｒｉａｍｙｃｉｎ１ｍｇ／ｋｇｂｏｄｙｗｔｔｗｉｃｅａｗｅｅｋｆｏｒ８ｗｅｅｋｓ．Ｗｅｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｔｗｏ
ｍｅｔｈｏｄｓｂｙｐａｔｈｏｌｏｇｙｒｅｓｕｌｔａｆｔｅｒ３ｗｅｅｋｓ．ＴｈｅｗｈｏｌｅｍｅｄｕｌｌｏｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄａｎｄＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅ
ｕｓｅｄｔｏｉｓｏｌａｔｅＭＳＣｓ，ａｎｄｔｈｅｎｏｂｓｅｒｖｉｎｇｔｈｅｇｒｏｗｔｈｐｒｏｐｅｒｔｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｆｔｅｒ３ｗｅｅｋｓｏｆｆｉｎａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｃｈａｎｇｅｓｏｆ
ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍｃｏｉｎｃｉｄｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＤＣＭ．Ｔｗｏｗａｙｓｏｆａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇｈａｄｔｈｅｓａｍｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｂｙｔｈｅｗｈｏｌｅｍｅｄｕｌｌｏｃｕｌ－
ｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄ，ｃｅｌｌｎｕｍｂｅｒｗｅｇｏｔｗａｓｇｒｅａｔｅｒｔｈａｎｔｈａｔｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ｂｕｔｔｈｅＰｕｒｉｔｙｗａｓ
ｗｏｒｓｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＴｈｅＤＣＭｒａｂｂｉｔｍｏｄｅｌｗｈｉｃｈｐｒｅｐａｒｅｄｂｙｔｗｏｗａｙｓｏｆａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇｗａｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈｅｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙｃｈａｎｇｅｓｏｆ
ＤＣＭｉｎｈｕｍａｎａｎｄｗｅｓｕｇｇｅｓｔｔｈｅｗａｙｏｆａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇｂｙｏｎｃｅａｗｅｅｋ．ＷｅｃａｎｃｈｏｏｓｅｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｃｕｌｔｕｒｉｎｇｔｈｅＭＳＣｓｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｄｅｍａｎｄｓｏｆｃｅｌｌｎｕｍｂｅｒａｎｄｃｅｌｌｐｕｒｉｔｙｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄｉｌａｔｅｄｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ；ａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌ；ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ；ｃｕｌｔｕｒｅ；ｒａｂｂｉｔ
（ＣｈｉｎＪＬａｂＤｉａｇｎ，２０１０，１４：１５３９）
扩张型心肌病（ｄｉｌａｔｅｄｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ，ＤＣＭ）是
心肌病变伴心功能障碍的一组疾病，动物模型制备
对于治疗方法的选择以及临床疗效观察有着十分重
要的意义
［１，２］。
骨髓间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ
ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＭＳＣｓ）是存在于骨髓中的一种非造血干细
胞，具有强大的分化潜能，还可以进行跨胚层分化。
研究表明ＭＳＣｓ取材相对容易，体外培养扩增迅速，
异体移植无免疫排斥反应，已成为一种理想的细胞
工程学种子细胞。
１ 材料与方法
１．１ 研究对象
健康纯种日本大耳白兔５０只（购自哈尔滨医科
大学附属第二医院动物实验中心），雌雄不限，体质
量２．００ｋｇ－２．２５ｋｇ，平均（２．０３±０．２５）ｋｇ，随机分
为３组，Ａ组２０只，Ｂ组２０只，对照组１０只，各组动
物年龄体质量均无显著性差异。
１．２ 兔扩张型心肌病模型的制备
将注射用盐酸阿霉素（多柔比星）用生理盐水稀
—９３５１—皛
中国实验诊断学 ２０１０年１０月 第１４卷 第１０期
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释成０．５ｍｇ／ｍｌ。Ａ组，耳缘静脉注射盐酸阿霉素，
每周１次，每次２ｍｇ／ｋｇ；Ｂ组，耳缘静脉注射盐酸阿
霉素，每周２次，每次１ｍｇ／ｋｇ；对照组，注射等量生
理盐水，均连续８周。Ａ组和Ｂ组两组注射盐酸阿
霉素的总量相同，均为１６ｍｇ／ｋｇ。为避免阿霉素对
心脏急性中毒作用的干扰，两组动物均于用药结束
后３周处死，取心肌行病理学检查。
１．３ 兔ＭＳＣｓ体外培养
１．３．１ 密度梯度离心法 选取２月－２．５月龄大耳
白兔，体质量１．７５ｋｇ－２．０ｋｇ，耳缘静脉注射戊巴比
妥钠麻醉，于无菌条件下使用注射器抽取５ｍｌ肝素
生理盐水混合液，然后抽取兔双侧股骨骨髓共１５
ｍｌ。将２０ｍｌ肝素骨髓混合液平均分成４份注入离
心管，铺于等量密度为１．０７７的淋巴细胞分离液上，
天平配平，２０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ；液体分成４层，
吸取第２层乳白微透明液体层（包括其中粉红色絮
状物）平均置入两个离心管中，加入ＰＢＳ定容至１０
ｍｌ，２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；弃上清液再次加入ＰＢＳ
定容至１０ｍｌ，吸管吹打混匀，再次离心５ｍｉｎ；弃上
清液，离心管底部白色细胞层即为ＭＳＣｓ。加入
ＤＭＥＭ／胎牛血清培养基（３－５ｍｌ），混匀细胞后吸入
培养瓶置入孵箱（温度３７℃，饱和湿度５％ＣＯ２）培
养。首次７２ｈ换液，以后每４８ｈ换液一次，操作中严
格无菌。首次换液时加入ＰＢＳ冲洗２－３次，以后每
次换液均用ＰＢＳ冲洗１－２次。待培养瓶中８０％左
右细胞贴壁后即可传代。首先吸出培养瓶中培养
液，加入ＰＢＳ洗去残留的培养液后吸出；然后加入
０．２５％胰酶，显微镜下观察，待细胞的长梭形结构变
圆、变亮后立即弃掉胰酶加入培养液终止消化；最后
吸取培养瓶中培养液，借助冲击力吹打瓶底贴壁细
胞令其自瓶壁脱落，将细胞悬液平均置入两个培养
瓶即可
［３］。
１．３．２ 全骨髓培养法 选取１月龄大耳白兔，体质
量约为０．７５ｋｇ－１．０ｋｇ，由于动物体重较小，可使用
水合氯醛腹腔注射麻醉，方法简单易行，且较戊巴比
妥钠安全。无菌条件下逐层切开分离出兔双侧股
骨，注意保持股骨干净完整。将分离出的两段股骨
放入培养皿中加入７５％酒精浸泡，５分钟后移入另
一无菌培养皿中，剪去两端干骺端暴露骨髓腔，注射
器抽取１０ｍｌＤＭＥＭ／胎牛血清培养基冲洗骨髓腔，并
将冲下的骨髓和培养基混匀。将培养基和骨髓的混
合物平均置入两个培养瓶，孵箱中培养。首次４８ｈ
半量换液，即吸出原瓶内１／２的培养液，加入等量新
鲜培养液。再过４８ｈ后全量换液，操作中严格遵循
无菌原则。传代方式同前。
２ 结果
２．１ 动物的一般情况
Ａ组首次注药后动物死亡１只，后于第５周至
第９周每周死亡１只，共存活动物１４只，死亡率为
３０％，体重减轻２５％；Ｂ组，分别于第４周、５周、７周
各死亡１只，第８周死亡２只，共存活动物１５只，死
亡率为２５％，体重减轻２７％；对照组于整个试验过
程中无动物死亡，且体重增加１３％。Ａ组和Ｂ组动
物均出现掉毛，食欲减退，耳部感染，精神萎靡等情
况，对照组上述情况均无。Ａ组与Ｂ组死亡率及体
重减轻率比较无统计学意义（Ｐ＜０．０５）。
２．２ 组织形态学观察
给药结束后３周处死动物取其心脏，甲醛固定
ＨＥ染色。可见Ａ、Ｂ组心肌细胞呈广泛水肿和空泡
变性的改变，很多部分可见心肌脂肪变性或坏死，细
胞间质水肿，细胞间隙增宽，并可见少量炎性细胞浸
润。对照组心肌细胞排列整齐，细胞间隙不宽，细胞
间质丰富且均匀，见图
１。
注：图左为对照组兔心肌切片，右图为模型组兔心肌组织切片
图１ 心肌病理组织图（ＨＥ×４００）
２．３ 细胞培养的一般情况
２．３．１ 密度梯度离心法 首次换液后可以去除绝
大部分不贴壁的杂质细胞，只有少量悬浮的圆形杂
质细胞，可见呈螺旋状、放射状集落生长的梭形或纺
锤形的ＭＳＣｓ。根据细胞生长情况决定传代时机。
传代至第５代以后，细胞逐渐变得宽大畸形，增殖活
性亦减退，尤其当细胞浓度减低过多时更容易出现
细胞形态的改变。
２．３．２ 全骨髓培养法 首次半量换液后可见瓶内
大量杂质细胞，培养液混浊。４８ｈ全量换液后仍有
较多杂质细胞，镜下可见大量圆形悬浮细胞和杂质
团，也有大量的旋涡状集落生长的纺锤形ＭＳＣｓ。一
—０４５１—皛
ＣｈｉｎＪＬａｂＤｉａｇｎ，Ｏｃｔｏｂｅｒ，２０１０，Ｖｏｌ１４，Ｎｏ．１０
换页
艇澍鬟，
般于第２次换液后２日即可传代。随着换液次数增
多杂质细胞逐渐减少，最终可获得较纯净的ＭＳＣｓ。
此法选用１月龄左右的日本大耳白兔，ＭＳＣｓ数量多
且生发能力较强，见图
２。
注：图左为密度梯度离心法首次换液后细胞状态，图右为全骨
髓培养法首次换液后细胞状态
图２ 首次换液后细胞状态
３ 讨论
扩张型心肌病是当前严重威胁人类健康的主要
心血管疾病之一，ＤＣＭ动物模型是研究治疗方法和
观察疗效的重要工具
［４－５］
。本研究结果表明兔作为
实验动物经济有效，经病理证实ＤＣＭ模型确切。
ＭＳＣｓ在损伤组织的修复，尤其是不可再生细胞组织
的修复中起到了重要作用，细胞的数量和质量是基
础。
３．１ 两种造模方法的比较
在进行ＤＣＭ模型的制备过程中，分别采用了文
献介绍的两种造模方法，即Ａ组每周给药１次每次
２ｍｇ／ｋｇ，Ｂ组每周给药２次每次１ｍｇ／ｋｇ，均持续８
周，总剂量一致。比较两种给药方式后，发现两组动
物死亡率和体重减轻率无统计学意义，且动物的一
般状况也无明显差异。Ａ组于首次注药后有１只动
物死亡而Ｂ组无动物死亡，主要考虑与动物的个体
差异、急性过敏反应或气体栓塞有关，而与给药剂量
无关，因为无论是１ｍｇ／ｋｇ还是２ｍｇ／ｋｇ均为不会致
死的小剂量。两组动物的心肌病理均呈ＤＣＭ样改
变，无明显差别。考虑到阿霉素对给药局部血管和
皮肤的损害作用，减少给药时对动物造成的刺激影
响，推荐采用每周１次，每次２ｍｇ／ｋｇ的给药方式。
３．２ 两种细胞培养方法的比较
目前对ＭＳＣｓ体外纯化扩增的方法包括密度梯
度离心法，全骨髓培养法（又称直接贴壁筛选法），流
式细胞分离法，免疫磁性分离法
［６－７］。
虽然流式细
胞分离法和免疫磁性分离法分离特异性较高，但由
于所需骨髓量较大，且仪器昂贵费用较高，本研究采
用密度梯度离心法和全骨髓培养法进行ＭＳＣｓ的体
外扩增。密度梯度离心法利用细胞密度不同的沉降
原理，用淋巴细胞分离液将红细胞、白细胞和间充质
细胞有效的分离开，通过１－２次换液后即可获得纯
度较高的ＭＳＣｓ，且视野清晰观察方便。但此法所需
骨髓量较全骨髓培养法大，操作步骤相对复杂，损失
细胞相对较多，最终获得的细胞虽纯度较高但数量
相对较少。全骨髓培养法利用血液中三系细胞均不
贴壁生长只有ＭＳＣｓ贴壁生长的特性，通过数次换
液除去不贴壁的杂质细胞，故又称直接贴壁筛选法。
此法操作简单，最初存在于培养液中的杂质细胞对
ＭＳＣｓ的生长无明显抑制，所得细胞数量较多，缩短
了原代的生长周期。但此法需经多次换液后方可去
除杂质细胞，由于红细胞沉积粘附于培养瓶底壁清
除困难，用吸管吹打清除的过程中可能损失部分尚
未牢固贴壁的ＭＳＣｓ。且由于漂浮的杂质细胞数量
较多，培养液混浊，视野不够清晰，为观察造成了一
定困难。首次半量换液就是希望可在早期去除部分
红细胞，以减少在底壁的沉积粘着；同时由于杂质细
胞较多、细胞数量大，及时更换部分培养液可以保证
ＭＳＣｓ的营养供应。两种方法最终均可获得ＭＳＣｓ，
可根据不同实验中具体需要的细胞数量和细胞纯度
进行选择。
体外培养ＭＳＣｓ易受血清浓度、贴壁时间、种植
密度、培养温度等多种因素影响，尤其是传代时的种
植密度直接影响了细胞的形态和增殖能力。接种密
度低会造成细胞生长缓慢变得宽大畸形，失去原有
的长梭形细胞形态；接种密度高细胞堆积生长，造成
接触抑制，观察时可见细胞界限不清。文献报道多
采用１∶２的比例进行传代，即１瓶平均分为２瓶，本
实验中多采用１∶１．５的比例进行传代，即１瓶分为１
瓶半或２瓶分为３瓶，以保证较高的细胞密度，细胞
分泌的细胞生长因子量多，确保获得形态标准、增殖
能力较强的细胞。
结论，反复多次小剂量耳缘静脉注射阿霉素的
累积心肌毒性作用，可以成功制备兔ＤＣＭ模型；应
用密度梯度离心法和全骨髓培养法均可获得ＭＳＣｓ，
为研究ＭＳＣｓ的进一步应用奠定基础。
作者简介：孙敏（１９８２－），女，硕士研究生，研究方向为心血
管疾病的超声诊断。
参考文献：
［１］９ＲｅｃｃｈｉａＦＡ，ＬｉｏｎｅｔｔｉＶ．ＡｎｉｍａｌＭｏｄｅｌｓｏｆＤｉｌａｔｅｄＣａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙｆｏｒ
—１４５１—皛
中国实验诊断学 ２０１０年１０月 第１４卷 第１０期
换页
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立及超声评价［Ｊ］．中国医学影像技术，２００６，２２（４）：５４８．
［６］李艳菊，李 宁，胡亮杉，等．大鼠骨髓间充质干细胞体外培养方
法的改进［Ｊ］．中国组织工程研究与临床康复，２００９，１３（１）：７１．
［７］王佳南，张晓刚，汤为学，等．大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养
条件［Ｊ］．中国组织工程研究与临床康复，２００９，１３（１４）：２７４０．
（收稿日期：２００９－１２－１４）
文章编号：１００７－４２８７（２０１０）１０－１５４２－０３
结核分枝杆菌ｋｍ基因的突变情况分析
王金河
１
，孙海林
２
，李洪敏
１
，梁建琴
１
，冯士生
１
（１畅解放军３０９医院结研所结核二科，北京１０００９１；２畅鄂尔多斯二院结核科）
摘要：目的 探讨结核分枝杆菌ｋｍ基因突变的情况。方法 通过传统梯度药敏试验和聚合酶链反应－单链构象
多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）分析２４８株分枝杆菌临床分离株耐药情况和ｋｍ基因的变化。结果 药敏试验耐药率为３２．７％
（８１／２４８），２４８株分枝杆菌临床分离株的１６ＳｒＤＮＡＳＳＣＰ电泳图谱均与结核分枝杆菌标准株相同。８１株耐卡那霉素分
离株中，２４株（２９．６％）ｋｍ基因ＳＳＣＰ泳动异常。结论 其部分耐药原因可能是由于Ｔ．Ｍ耐ＫＭ药物的ｋｍ基因突变所
致。
关键词：结核分枝杆菌；卡那霉素；ｋｍ基因
中图分类号：Ｒ３７８．９１
＋
１文献标识码：Ａ
ＴｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｔｈｅｒｅｌａｔｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＫｍｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ＷＡＮＧＪｉｎ－ｈｅ，
ＳＵＮＨａｉ－ｌｉｎ，ＬＩＨｏｎｇ－ｍｉｎ，ｅｔａｌ．（ＴｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，３０９ｔｈＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＰＬＡ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＫｍｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｋａｎａｍｙｃｉｎｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄＫｍｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎｉｎ２４８Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｃｌｉｎｉｃａｌｓｐｕｔｕｍｓｐｅｃｉｍｅｎｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ
ｂｙｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｄｒｕｇｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｓａｎｄＰＣＲ－ＳＳＣＰ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅｒａｔｅｏｆｄｒｕｇｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｓｗａｓ３２．７％（８１／２４８）．Ｔｈｅｅｌｅｃ－
ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆ１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ－ＳＳＣＰｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅ２４８Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＭ．ＴＢｓｔａｎｄａｒｄｓｔｒａｉｎ．２４
ｏｆｔｈｅ８１ｋａｎａｍｙｃｉｎｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｔｒａｉｎｓ（２９．６％）ｄｉｓｐｌａｙｅｄａｂｎｏｒｍａｌｉｎＰＣＲ－ＳＳＣＰｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｉｎｓｏｍｅｄｅｇｒｅｅ，Ｋｍｇｅｎｅ
ｍｕｔａｔｉｏｎｍａｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｋａｎａｍｙｃｉｎｏｆＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｓｔｒａｉｎｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，ｋａｎａｍｙｃｉｎ，Ｋｍｇｅｎｅ
（ＣｈｉｎＪＬａｂＤｉａｇｎ，２０１０，１４：１５４２）
当前，在治疗ＭＤＲ－ＴＢ的抗结核一线药物大部
分已经耐药
［１－４］，
人们开始把目光转向二线药物的
应用。其中，使用比较多的药物是卡那霉素（ＫＭ）。
现在常规药物敏感试验发现，临床亦出现ＫＭ耐药
的现象。传统的结核菌药敏试验能初步反映结核分
枝杆菌耐ＫＭ的表面现象，但不能分析结核分枝杆
菌是否发生本质（ｋｍ基因突变）的变化。本文运用
分子生物学方法，分析２４８株结核分枝杆菌临床分
离株的药敏和ｋｍ基因突变情况，研究ＫＭ耐药水平
和ｋｍ基因之间的关系，寻找其内在的联系。
１ 材料与方法
１．１ 菌种和菌株来源 结核分枝杆菌标准株来源
于中国药品生物制品检定所；２４８株结核分枝杆菌临
床分离株来源于本院２００６－２００７结核科住院病人
临床标本。
１．２ 分枝杆菌培养、菌种鉴定和药敏试验 按“结
核病诊断细菌学检验规程”进行分枝杆菌ＢＡＣＴＥＣ培
养、菌种鉴定和药敏试验。耐卡那霉素药物浓度标
准：１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ和１μｇ／ｍｌ分别为高度、中、
低度耐药
［５－７］。
１．３ 细菌ＤＮＡ的制备 采用本室自制的标本前处
理试剂盒提取ＤＮＡ，即：取标本０．５～１ｍｌ，加入等体
积的１ＸＴｒｉｓ．Ｈｃｌ－ＥＤＴＡ液，加入消化液５０μｌ，混均至
８０℃水水浴３０分钟，每５分钟混均１次，８０００ｒｐｍ
１０分钟，取上清１ｍｌ。向样本内加入１ｍｌ平衡酚，
颠倒混匀数次，勿振荡，８０００ｒｐｍ１０分钟，取上层水
—２４５１—皛
ＣｈｉｎＪＬａｂＤｉａｇｎ，Ｏｃｔｏｂｅｒ，２０１０，Ｖｏｌ１４，Ｎｏ．１０
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