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左旋四氢巴马汀对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤后海马CA1区Fas和F
关键字:损伤,对大,GH,KL,EF,CD,yz,AB,MN,OP, 发布时间:2011-08-21

医药导报2010年9月第29卷第9期 ?药物研究? 左旋四氢巴马汀对大鼠局灶性脑缺血一再灌注损伤后 海马CA,区Fas和FasL蛋白表达的影响 马小亚1,武冬梅2,李 明3 (1.两安交通大学医学院第二附属医院药剂科,710004;2.西安市儿奄医院,710003;3.西安交通大学医学院组织 胚胎学教研室,710061) [摘要]目的探讨左旋四氢巴马汀(L-THP)对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的保护作用及对海马CA.区凋 亡蛋白Fas、FasL表达的影响。方法参照改良Longa法建立局灶性脑缺血-再灌注模型,应用ImageProPlus6.0专业图 像分析软件测定脑梗死体积,比色法测定肌酸激酶(CK)活力,用免疫组化法分别检测缺血侧海马CA.区Fas、FasL阳性 表达。结果与模型组比较,L?THP能够缩小局灶性脑缺血一再灌注损伤大鼠脑梗死体积,降低血清CK活力。降低缺血 侧海马CA。区Fas、FasL凋亡蛋白的表迭。结论L.THP可能通过抑制神经元凋亡蛋白Fas、FasL表达,而对脑组织起到 保护作用。 [关键词]四氢巴马汀,左旋;脑缺血-再灌注损伤;脑保护作用;神经元凋亡蛋白 [中图分类号]R971.1;R743[文献标识码]A[文章编号]1004—0781(2010)09一lll5—05 TheEffectsofL-tetrahydropalmatineontheExpressionofApoptosisProteinFasand FasLinHimppocampalCA lafterFocalCerebralIschemiaReperfusionInjuryin Rats MAXiao-yal,wUDong—mei2,LIMin93(1.DepartmentofPharmacy,theSecondAffiliatedHospital,Schoolof Medicine,Xi7anJiaotongUniversity,Xian710004,China;2.XianChildrensHospital,Xi7an710003,China; 3.DepartmentofHistologyandEmbryology,SchoolofMedicine,Xi。anJiaotongUniversity,Xt’an710061, China) ABSTRACT Objective TostudytheprotectiveeffectsofL—tetrahydropalmatine(L?THP)onfocalcerebralischemia reperfusioninjuryinratsandexpressionofapoptosisproteinFasandFasLinhimppocampalCAl. MethodsModifiedlJ0nga methodwasemployedtoestablishtheanimalmodeloffocalcerebralischemiareperfusion,ImageProPlus6.0softwarewasused todetectvolumeofcerebralinfarction,creatinekinase(CK)levelwasexaminedbyeolorimetry,andimmunohistochemical methodwasappliedtoanalyzeFasandFasLexpressedcells.Results Comparedwithmodelcontrol,L—THPdecreasedinfarct volume,CKactivityandreducedthelevelofFasandFasLinhimppocampalCAlafterfocalcerebralischemiarepeffusioninjury inrats.ConclusionLTHPhasthepmtectiveeffectonfocalcerebralischemiareperfusioninjurybyinhibitingneuron expressionofapoptosisproteinFasandFasL. KEYWORDS L-tetrahydropalmatine;Cerebralischemiareperfusioninjury;Cerebralprotectioneffect;Apoptosisprotein ofuelve‘:eU 脑血管疾病是严重威胁人类生命健康的常见疾病 之一,其中缺血性脑血管病发病人数较多,约占脑血管 疾病患者的70%。脑缺血损伤可以导致迟发性神经 元死亡(DND)。研究表明,神经元凋亡在DND的发 展过程中起重要作用,Fas、FasL是凋亡诱导家族的重 [收稿日期]2009—08—21[修回日期]2009—09—28 [基金项目]‘陕西省科学技术研究发展计划项目[基金编 号:2008K13-02(2)] [作者简介]马小-哑(1965一),女,陕西绥德人,副主任药 师,硕士生导师,硕士,研究方向:临床药理学。电话:029— 87679250,E,mail:mxy916@163.com。 要成员之一,两者的结合是细胞凋亡的重要调节机 制。“。左旋四氢巴马汀(L—tetrahydmpalmatine,L. THP)作为镇痛、镇静、催眠药物已应用临床多年,基础 研究发现,L—THP是植物性钙离子阻滞药,具有抗心肌 缺血、减轻大鼠全脑缺血一再灌注损伤及减少神经元凋 亡的作用。笔者在本实验研究L—THP对局灶性脑缺 血一再灌注损伤的保护作用及对神经元凋亡蛋白Fas、 FasL表达的影响。 1材料与方法 1.1实验动物健康SD品系大鼠160只,平均体质 量(240+20)g,雌雄兼有,由西安交通大学动物实验 万方数据 换页 ?1116?HeraldofMedicineV01.29No.9September2010 中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK(陕)2007. 001。 1.2药物与试剂 受试药物:左旋四氢巴马汀(罗通 定片,湖南洞庭药业股份有限公司提供,批号:070609, 每片含L.THP30mg),实验前以纯化水配成0.4%, 0.2%,0.1%的混悬液,临用前用涡旋混合器混匀后使 用。阳性对照药:尼莫地平片(正大青春宝药业有限 公司生产,批号:070987,每片含尼莫地平20mg),以 纯化水配成0.1%的混悬液。10%水合氯醛(西安交 通大学医学院第二附属医院制剂室生产)。肌酸激酶 (CK)试剂盒(南京建成生物工程研究所提供);兔抗 鼠Fas、FasL多克隆抗体、山羊抗兔IgG抗体及免疫组 化DAB显色剂(北京奥博森生物技术有限公司提供。 1.3仪器SD-78型双极电凝器(上海医用电子仪器 厂)。UV-2550紫外可见分光光度计(日本岛津公司)。 AO组织切片机(美国optical公司)。PYX—DHS隔水式 电热恒温培养箱(上海市跃进医疗器械厂)。FM包埋 箱(上海福玛实验设备有限公司)。OlympusBx40型光 学显微镜(日本Olympus株式会社)。Q550CW图像信 号采集与分析系统(德国LEICA公司)。 1.4实验动物分组与给药方法①将60只大鼠随机 分为6组,每组10只。假手术组、模型组给予纯化水 10mL?kg~,阳性对照组给予尼莫地平溶液 10mg?kg一,低、中和高剂量药物组给予L—THPl0,20, 40mg?kg~。在缺血2h再灌注6h测定脑梗死体积 和血清CK活力。②将100只大鼠随机分为5组,假 手术组、模型组给予纯化水10mL?kg~,阳性对照组 给予尼莫地平溶液10mg?kg~,中和高剂量药物组给 予L—THP20,40mg?kg~,每组根据缺血一再灌注时间, 分别缺血2h再灌注6,12,24,48h,合计20小组。免 疫组化法测定Fas、FasL的阳性表达。各组动物连续 灌胃给药5d,qd,再灌注期间连续给药。 1.5模型的制备大鼠局灶性脑缺血一再灌注模型的 制备采用Longa法稍作改良心j,建立大鼠大脑中动脉 阻塞(MCAO)局灶性脑缺血一再灌注模型:麻醉大鼠, 于颈部左侧做切口,在颈外动脉(ECA)剪--d,口,将 线栓自ECA经颈总动脉(CCA)分叉处插入颈内动脉 (ICA),将线栓推至大脑中动脉(MCA),待大鼠麻醉清 醒后,若观察到行走时向右侧转圈即认为符合实验的 入组标准,到各灌注时间拔出线栓,实行再灌注。假手 术组仅将尼龙线放入ECA,不进入ICA。 1.6血清CK活力测定采用摘眼球法,取大鼠新鲜 血液2mL,待血清析出后,3000r?min‘1(r--15em)离 心10rain。取上层血清约1mL,装于具塞离心管中, 参照CK试剂盒说明书,按步骤操作,室温下用紫外分 光光度计测定各组吸光度(A值),计算CK活力。 1.7脑梗死体积测定将进行完眼球取血的大鼠迅 速断头处死,取出全脑,一20℃速冻10min,去除嗅球、 小脑和低位脑千,然后将脑从额极至枕极连续冠状切 片,每2mm一张,共5或6片。将脑切片放入1% ,rrc磷酸缓冲液中,在37℃水浴箱中温孵30min,用 10%多聚甲醛固定24h后,将固定的脑片按切片顺序 排列,数码相机摄相。利用ImageProPlus6.0专业图 像分析软件测出每个脑片梗死面积,梗死体积=梗死 面积X厚度(2mm),并将所得数值相加得全脑梗死灶 体积的近似值。 1.8标本采集和组织切片的制备将缺血一再灌注不 同时间段的大鼠,用10%水合氯醛3mL?kg。1腹腔麻 醉,暴露心脏,用灌注器经心尖、左心室插入到主动脉 内,先用0.9%氯化钠溶液,然后改用4%多聚甲醛灌 注、固定大鼠约1h,灌注完毕后,取出全脑去除嗅球、 小脑及低位脑干后,冠状切取海马区脑组织,浸于原固 定液24h(4℃)后,取出流动水冲洗24h,再将冲洗后 的脑组织经85%乙醇浸泡脱水以备石蜡切片。经常 规梯度乙醇脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋,切片,用于 Fas、Fasl免疫组化染色。 1.9图像分析及采集 免疫组化染色后在400倍光 学显微镜下,在大鼠缺血侧海马CA.区随机选取5个 视野进行观察,以细胞内出现鲜亮的棕黄色颗粒为阳 性细胞。并记录Fas、FasL阳性细胞表达总数,取其平 均值。然后采用图像信息采集与分析系统采集图片。 1.10统计学方法实验数据以均数±标准差(i±s) 表示,采用SPSSl3.0统计软件进行分析,两组以上计 量数据比较采用单因素方差分析(one—way,ANOVA), 其中两两比较采用LSD检验,P<0.05表示差异有显 著性。 2结果 2.1大鼠脑梗死体积和血清CK活力的检测结果 TTC染色后观察到,正常组织呈红色,梗死灶呈苍白 色,界限明显。假手术组脑组织均匀红染无梗死灶,其 他各组非缺血侧染色基本呈红色,脑缺血一再灌注后脑 梗死体积明显增大,缺血侧模型组梗死范围最大,其他 给药组梗死范围有不同程度的缩小。与模型组比较, 阳性对照组、高剂量药物组的脑梗死体积明显减少 (P<0.01),而低剂量和中剂量药物组脑梗死体积虽有 所缩小,但差异无显著性。可见L—THP可以缩小由于 局灶性脑缺血一再灌注损伤造成的脑梗死体积。模型 组与假手术组比较,大鼠脑缺血一再灌注后血清CK活 万方数据 换页 医药导报2010年9月第29卷第9期 ?1l17? 力明显升高(P<O.01)。与模型组比较,阳性对照组、 中剂量和高剂量药物组血清CK活力明显降低(P< 0.01)。低剂量药物组CK活力虽有所降低,但差异无 显著性。说明L-THP具有降低局灶性脑缺血一再灌注 大鼠血清CK活力的作用。见表1。 表1L.THP对局灶性脑缺血.再灌注大鼠脑梗死体积、血 清CK活力的影响 Tab.1TheeffectsofL.THPonvolumeofcerebral infarctionandserumCKactivityafterfocalcerebralischemia- reperfusioninrats i+s 缉别 大鼠/ 剂量/脑梗死体积/ CK/ 4… 只 (mg?kg。) (mm3)(g?L。) 高剂馈药物组 lO40173.0±53.8“1.6±0.4“ 中剂量药物组 lO20255.1±57.22.3±0.7“ 低剂苗药物组 1010282.2_+27.52.8±0.4 阳性对照组 lO10 180.1-+58.1“1.0+0.3“ 模型组 10 … 294.0±72.8“3.3+0.4也 假于术组 10…0.0土0.00.9±O.1 与模型组比较,“P<O.01;与假手术组比较,~P<O.Ol Comparedwiththemodelgroup,“P<0.0l;Comparedwith theshamoperationgroup,“P<0.01 2.2大鼠神经元Fas蛋白表达情况与假手术组比 较,模型组中海马CA,区Fas的阳性细胞表达在各灌 注时间段均明显增加(P<0.01)。在脑缺血2h再灌 注6h阳性表达就开始增多,随着再灌注时间的延长, 在再灌注24h时Fas的阳性细胞表达数相对6,12h 有所增多,达到高峰,在48h降低。与模型组比较,阳 性对照组,中剂量和高剂量药物组在海马CA。区Fas 的阳性细胞表达在各灌注时间均有所减少,差异有显 著性或极显著性(P<O.05或P<O.01)。说明L—THP 能减少局灶性脑缺血一再灌注损伤大鼠海马CA。区Fas 的阳性细胞表达。与阳性对照组比较,中剂量和高剂 量药物组在降低大鼠局灶性脑缺血一再灌注后海马 CA.区Fas阳性细胞表达方面差异无显著性。见表2。 光学显微镜下观察到缺血侧假手术组海马CA,区可见 散在少量Fas阳性细胞表达,模型组可见主要表达在 胞质和胞核的淡棕色的弱阳性颗粒沉积。其余各干预 组见少量淡棕色的阳性细胞。见图1。 2.3大鼠神经元FasL蛋白表达情况脑缺血一再灌 注后,模型组在缺血2h再灌注6h开始FasL阳性细 胞有明显表达,在再灌注24h时表达的阳性细胞数明 显增多,达到高峰,在48h开始趋于降低。与假手术 组比较,海马CA。区FasL的阳性细胞表达在再灌注6, 12,24h均明显增加,差异有显著性或极显著性(JP< 0.05或P<0.01),再灌注48h组虽然FasL蛋白阳性 表达数增多,但差异无显著性。说明局灶性脑缺血一再 表2L-THP对局灶性脑缺血-再灌注大鼠海马CA。区Fas阳性细胞表达的影响 Tab.2TheeffectsofL-THPontheexpressionofFas-positivecellsafterfocalcerebralischemia-reperfusioninhippocampal CA,amofratsi±s 。。 大鼠/ 剂量/ 海马CA,【)(Fas孵j性细胞数 …。 只(mg.kz一1) 6h12h24h48h 高剂最药物组 2040 4.7±0.6“6.7-.1.5”6.0±0.3“5.1±0.2“ 中剂量药物组 2020 6.0±0.5“7.0±0.4”8.0±0.4“9.0+1.6n 阳性对照组 20lO5.O-vO.6“6.0±0.2“ 6.0±0.9“4.8-+0.2“ 模型组 20 … 11.0±0.7”14.0+0.6”16.O±1.4“11.0±1.6妇 假手术组 20 … 3.0±0.24.0+0.37.O±0.34.0±0.4 与模型组比较,“P<0.01,“P<0.05;与假手术组比较,”P<0.01 Comparedwiththemodelgroup,“P<O.01,”P<O.05;Comparedwiththeshamoperationgroup,”P<0.Ol AB C DE 图1各组再灌注24h海马CA,区FAS免疫组化染色(×400) A:假手术组;B.模型组;C.阳性对照组;D.高剂量药物组;E.中剂量药物组 Fig.1 ImmunohistochemicalstaininginofFAShippocampalCAlan组at24hafterreperfusion(x400) A.shamoperationgroup;B.modelgroup;C.positivecontroldruggroup;D.highdosedruggroup;E.mediumdosedruggroup 万方数据 换页 ?1118?HeraldofMedicineV01.29No.9September2010 灌注损伤能够引起脑组织FasL的阳性表达。与模型重要的临床意义。因线栓法MCAO模型具有不开颅、 组比较,阳性对照组在各灌注时间均能降低海马CA,损伤小、效果稳定且可准确控制缺血及再灌注时间的 区FasL的阳性细胞表达,在再灌注24h作用显著(P< 优点而被认为是脑缺血-再灌注损伤的标准模型"J。 0.01),各给药干预组中,高剂龟药物组在海马CA,区实验采用严格的动物实验纳入标准和1Trc染色结合 FasL的阳性表达在灌注6,12,24h时均有明显的减的方法,双莺标准验证r脑缺血动物模型是否合格。 少,差异有显著性或极显著性(P<O.05或P<0.01),在脑缺血引起脑血流阻断后,短期的脑组织缺血后 再灌注48h时虽有所减少,但差异无显著性。说明应再灌注可以减轻缺血引起的脑损伤,但长时间的缺血 用L—THP40mg?kg‘1能够降低局灶性脑缺血-再灌注恢复血液灌流后不但不能恢复其功能和结构,反而加 损伤后脑内FasL的阳性表达,在缺血-再灌注早期作重其功能障碍和结构损伤。目前多认为MCAO缺血 用显著。与阳性对照组比较,中剂量和高剂量药物组 90—180min为理想的缺血时间【4]。本实验在预实验 差异无显著性。说明阳性对照组与中剂量和高剂量药期间通过1Trc染色分别比较在缺血1,2,3h时,脑组 物组降低局灶性缺血一再灌注大鼠脑内FasL阳性表达织梗死面积的大小,发现缺血1h脑梗死面积较小,缺 方面差异无显著性。见表3。光学显微镜下观察到缺 血2h时梗死面积增大,且比较稳定,3h时可以获得 血侧假手术组海马CA,区可见散在分布表达FasL蛋最大的梗死面积。通过比较缺血.再灌注后动物的死 白的阳性细胞,模型组海马CA,区明显观察到棕黄色亡率,发现缺血2h再灌注48h动物的死亡率为13%, 分布的阳性细胞,表现为细胞固缩、深染、结构不清,细 缺血3h再灌注48h后动物的死亡率达到39%,因此 胞膜或胞质有棕黄色颗粒沉积,以细胞膜阳性颗粒沉本实验选择缺血2h既满足了缺血一再灌注后治疗所要 积最为明显。其余各给药干预组FasL阳性细胞数明求的最佳治疗时间窗,又能提高实验的成功率,可以有 显减少。见图2。效反映L—THP抗局灶性脑缺血一再灌注损伤的治疗效 3讨论果及能更好的研究L—THP保护脑缺血?再灌注损伤的 临床缺血性脑血管病中,60%患者为大脑中动脉机制。 闭塞,因此研究MCAO所造成的脑缺ffIL疾病具有十分7rrc染色腑梗死体积测量是研究药物对脑血管疾 表3L-THP对局灶性脑缺血一再灌注大鼠海马CA。区FasL阳性细胞表达的影响 Tab.3TheeffectsofL-THPontheexpressionofFasL-positivecellsafterfocalcerebralischemia-reperfusioninhippocampal CA.areaofratsi±s 高剂苗药物组 20406.1±0.9”9.5±0.7“13.7±2.3“14.2±2.9 中剂量药物组 20 2012.2±3.6 14.8+2.015.0+1.6“12.3±2.0 阳性对照组 201010.3±2.5 12.4±1.613.4+1.7“ 12.6±2.2 模型组 20 … 11.3士0.8“18.4+2.1”25.8-+3.4“ 15.2±2.1 假手术组 20 … 6.2±1.28.7-+1.66.2±1.39.3-+1.9 与模型组比较,“P<0.05。一P<0.Ol;与假手术比较,“P<0.05,“P<0.Ol Comparedwiththemodelgroup,‘1P<0.05,’2P<0.01;Comparedwiththeshamoperationgroup,+3P<O.05,’4P<O.01 AB C DE 图2各组再灌注24h海马CAl区FasL免疫组化染色()<400) A.假手术组;B.模型组;c.阳性对照组;D.高剂量药物组;E.中剂量药物组 Fig.2InnnunohistochemicalstainingofFasLinhippocampalCAl areaat24hafterreperfusion(×400) A.shamoperationgroup;B.modelgroup;C.positivecontrolgroup;D.highdosedruggroup;E.mediumdosedruggroup 万方数据 换页 医药导报2010年9月第29卷第9期 -1l19? 病疗效的常规方法,是神经保护药物基础研究的重要 评价指标,具有简捷、直观的特点。其基本原理:TTc (2,3,5一氯化三苯基四氮唑)是一种脂溶性光敏感复合 物,它是呼吸链中吡啶.核苷结构酶系统的质子受体, 与正常脑组织中的脱氢酶反应而罨深红色脂溶性物 质,而梗死组织内因脱氢酶活性下降,不能反应,故不 显色而呈苍白色。实验中通过1TrC染色测定脑组织 梗死体积发现,假手术组未见脑梗死灶,脑片成均匀红 染。模型组腑梗死体积最大,在冠状切片中,以第3片 脑片梗死范围最大,这与大脑中动脉所支配的供血区 域相吻合。实验结果表明L—THP可以挽救因缺血引 起的缺血半暗带内的细胞,缩小由于局灶性脑缺血一再 灌注损伤造成的脑梗死体积,起到神经保护的作用。 CK是一种细胞内酶,主要分布在骨骼肌,其次为 脑组织和心肌。研究认为,血清CK一样可以作为脑 内神经细胞损害的特异性生化指标,当脑组织受到损 伤时,CK活力增加一。。本实验结果湿示L—THP具有 降低局灶性脑缺血一再灌注大鼠血清CK活力的作用, 从生化角度间接反映L—THP对局灶性脑缺血再一灌注 损伤的脑组织具有保护作用。 Fas属于肿瘤坏死因子受体家族成员,为凋亡刺激 因子,其配体是细胞凋亡因子FasL,Fas、FasL是凋亡诱 导家族的重要成员之一。Fas与FasL结合,可促发一 系列细胞内反应,最终导致靶细胞的Caspase激活,凋 亡细胞增多:6】。本实验发现,脑缺血.再灌注损伤能够 引起腑组织Fas、FasL的阳性细胞表达增多,应用L— THP40mg?kg。能够下调局灶性缺血.再灌注损伤后 脑内Fas、FasL阳性细胞表达,减少局灶性脑缺血一再灌 注后神经细胞凋亡,这可能是其对脑缺血一再灌注损伤 保护机制之一。 脑缺血.再灌注损伤机制众多,目前大量的研究认 为L—THP可减少全脑缺血一再灌注损伤后神经元的死 亡,对脑缺血一再灌注损伤具有一定的保护作用。可能 通过在缺血一再灌注早期增加ATP含量,减少乳酸产 生,降低神经元凋亡的发生"1;阻断钙通道,减少钙超 载,抑制缺血.再灌注后脑组织钙聚集博o;同时能够通 过减少自由基产生、抑制炎症反应【9。和减轻一氧化氮 (NO)介导的神经毒性¨毗等机制发挥对脑缺血.再灌 注损伤的脑保护作用。本实验通过选择局灶性脑缺 血一再灌注模型,在此基础上观察L—THP对脑缺血.再 灌注损伤后凋亡蛋白Fas、FasL的影响,发现L-THP可 通过抑制神经组织内凋亡蛋白Fas、FasL表达,减少细 胞凋亡的发生,从而改善局灶性脑缺血一再灌注损伤大 鼠脑梗死体积,降低CK活力,起到脑组织保护作用。 [DOI]10.3870/yydb.2010。09。001 [参考文献] [1]李李,刘英,康相涛.主要凋亡基因对细胞凋亡的 调控[J].解剖科学进展,2007,13(1):62—65. 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