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地黄多糖的提取纯化及其对糖尿病小鼠血糖的影响研究
关键字:影响,研究,糖尿病,提取,及其,EF,IJ,CD,AB,wx 发布时间:2011-08-20

StraitPharmaceuticalJournalVol22No.92010 【5】陈颖珠.动脉粥样硬化和冠状动脉粥样硬化性心脏病[U】.北京: 人民卫生出版社。2007.271. 【6】李慧英.大蒜油的传统开发【J】.中成药.1993.t5(6):14. 【7】GebhardtR.Multipleinhibitoryeffectsofgarlicestraetsoneholesterol biosynthesisinhepatocytesU}.Lipids.1993。培(7】:613—619. 【8】AdogaGI,OsujiIEffectofgarficoilertractonBeruln,fiver蚴kidney eBgymesof ratsfedonhighSUCrOSeandalcoholdietsO].Biochemistry International.1986,13(4):615—624. 【9】何晓洋.优质大蒜出口潜力大【J】.农村实用技术与信息.2002 (8):16. 【lO)张骊,向智敏.超临界C()2用于蒜酶失活和大蒜SOD的保留【J】 .食品科学。1997(4):27—29. (11】余伯良。吴士业.不同脱臭方法对大蒜抗菌效力的影响【J】.中 国调味品.1998(8):8—11. [12】曾凡俊.张月天.陈松波.大蒜油软胶囊保健食品的研究[J].食 品与发酵工业.2002(12):24—27. 【13】李娜.大蒜的功效成分及其应用的研究进展CJ}.中国食物与营 养,2007(11):25—27. 地黄多糖的提取纯化及其对糖尿病小鼠血糖的影响研究 赵平鸽1,刘晓2(1.浙江省义乌中心医院义乌322000;2.徐州医学院药学院徐州221004) 摘要:目的研究从地黄中分离纯化多糖的方法,并探讨地黄多糖对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的降血糖作用。方法地黄粉束石油醚、乙 醚除去脂溶性杂质.80%的乙醇脱单糖、低聚糖.热水浸提液经浓缩,醇析,Savagc法除蛋白。离子水逆流透析.H2()2脱色得地黄粗多糖。苯酚.浓 硫酸比色法测多糖含量。将腹腔注射四氧嘧啶建立的糖尿病小鼠动物模型动物随机分为模型组、地黄多糖治疗组(RGP治疗组)、阿卡波糖治疗 组(AR治疗组).另设立正常对照组。每组给药后4周末测定空腹12h血糖(GLu)、甘油三酯(TG)、极低密度脂蛋白.胆固醇(VLDL.C)、总胆固 醇(TC)的含量及小鼠体重.对各组的血糖和血脂水平进行比较分析。结果①490nm为样品的吸收波长。线形回归方程为:Y=0.0056X+ 0.4361.相关系数R2=0.9995;地黄粗多糖的提取率为45.5%,总糖含量为35.2%。⑦与正常组相比。模型组体重降低、血糖升高,相比较有显 著性差异(P<0.05);AR治疗组、RGP治疗组与模型组相比.体重增加、血糖降低,相比较有显著性差异(P<0.05)。③模型组血清血脂水平显 著高于正常组(P<0.05);AR治疗组、RGP治疗组与模型组比较.TG、VLDL.C降低,相比较有显著性差异(P<0.05);治疗组与模型组比较TC 水平变化不大。差异无统计学意义(P>o.05)。结论该方法简便可行.可以作为地黄多糖提取分离纯化的有效方法;地黄多糖具有能缓解糖 尿病小鼠体重降低,降低糖尿病小鼠血糖水平,调节血脂紊乱的作用。 关键词:地黄多糖;提取纯化;糖尿病;血糖;,1,鼠 中圉分类号:R965文献标识码:A文章编号:1006.3765(2010).09.0029.04 ExtractionandpurifctionofrehmanniaglutinosapOIySaCCharideanditsel- fectonbloodglucoseindiabeticmice ZHAOPing-ge,LlUXiao(1.ZhejiangprovinceYiwuCentralHospital,Yiwu322000,China;2.CollegeofPharma- cy,XuzhouMedicalCollegeXuzhou221004,China) ABSTRACT:OBJECTIVETostudytheextractionandpurifctionofrehmanniaglutinosapolysaceharide(RGP) anditseffectonbloodglucoseindiabeticmiceinducedbythealloxan.METHODSTherehmanniaglutinosa powderwasremovedthefat一,solubleimpuritiesbyPetroleumetherandethylether,themonosaccharidesand oligosaecharideswaspeeledoffusing80%ethan01.Therehmanniaglutinosapolysaecharidewasextractedandpu— rifledthroughhotwaterextractedandconcentrated,precipitatedwithethanol,peeledoffproteinwithSavage method,deionizedwatercountercurrentdialysis,removedthepigmentin‘H202.TheRGPcontentwasdetected withPhenol—concentratedsulfuricacidcolorimetry.AlloxanWasadministeredintraperitoneallytoestablishdiabetic modelsinmice,afterthesuccessofmodeling,experimentalanimalsweredividedintothemodelgroup,theRGP treatmentgroup,ARtreatmentgroupandsetupanormalcontrolgroup.4weeksaftertreatment,the12hfasting bloodglucose(Gl。U),triglyceride(TG),verylowdensitylipoproteincholesterol(VLDL-C),totalcholesterol(TC) levelsandbodyweightofmiceweredetected,theeach group’Sbloodglucoseandlipidlevelswere ana一 ?29? 万方数据 换页 海峡药学2010年第22卷第9期 lyzed.RESULTS①Thesamples’UVabsorptionwas490nm,linearregressionequation:Y=0.0056X+ 0.4361,correlationcoefficientR2=0.9995;theextractionrateofRGPwas45.5%,totalsugar contentwas 35.2%.②Comparedwithnormalgroup,theweightlossandelevatedbloodglucoseinthemodelgroup,thediffer— encewassignificant(P<0.05);comparedwithmodelgroup,thegainweightanddecreasedbloodglucoseinthe ARtreatmentgroupandRGPtreatmentgroup.thedifferencewassignificant(P<0.05).③Theserumlipidlevels ofthemodelgroupweresignificantlyhigherthanthatofthenormalgroup(P<0.05);Comparedwiththemod— elgroup。theTGandVI,DI。。ClevelsoftheARtreatmentgroupandRGPtreatmentgroupdecreased,thediffer— encewassignificant(P<0.05);comparedwithmodelgroup,theTClevelsoftreatmentgroupwas nosignificant— lYdifference(P>0.05).CONCLUSl0N Thismethodissimpleandfeasible,canbeusedasaeffectivemethcIds ofRGPextractionandpurification:RGPcanalleviatetheweightlOSSofdiabeticmice,reducebloodglucoseIevels indiabeticmiceandregulatedbloodlipiddisorder. KEYWORDS:Rehmanniaglutinosapolysaccharide;Extractionandpurification;Diabetes;Bloodsugar;Mice 地黄为玄参科植物地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.) 的干燥根茎。为常用中药。现在药理已表明地黄在造血系统。 内分泌系统、免疫、抗肿瘤及心血管系统等有着广泛的生物活 性【lJ。许多植物多糖具有免疫促进作用,抗肿瘤作用。抗衰老 活性.降血糖活性,抗病毒活性,以及降血脂活性等。而且多 糖因其特殊的生物活性和无毒副作用而被广泛用于临床用 药、疫苗和保健食品。多糖作为提高机体免疫功能的保健品 已被广泛开发,但许多多糖产品仅仅停留在保健品阶段。未能 开发成药物,主要原因是多糖的分离纯化困难,技术不过关。 目前对地黄多糖的提取及分离纯化的研究少见报道,特别是 对地黄多糖的提取工艺的研究尚未见报道。 糖尿病(DM)是一组因遗传和环境因素相互作用引起的 临床综合症。因胰岛索分泌绝对或相对不足和靶细胞对胰岛 素敏感性降低,引起的糖、蛋白质、脂肪和继发性的水、电解质 代谢紊乱及酸碱平衡失调的内分泌代谢疾病.以高血糖为其 共同主要标志,近年来发病率呈逐渐增高的趋势C2)。目前对 糖尿病仍缺乏有效的治疗方法,临床采用的降糖药或存有毒 副作用,或价格昂贵,而且西药由于化学成分单一。作用机制 只是针对降低血糖的某一环节,长期应用造成靶器官钝化而 使其出现用药一段时间后疗效下降、不持久现象。近年来.国 内外对具有降糖作用的植物多糖的化学和药理研究进展迅 速,多糖类成分不仅是一种非特异性免疫增强剂,而且具有降 血糖、抗病毒、抗凝血等作用【3】。从天然植物中寻找安全有 效、廉价的降糖药物。己成为近年来人们关注的焦点。地黄中 含有丰富的多糖类物质,地黄多糖是地黄中的有效成分之一. E1益受到人们的关注,其研究也逐渐增多。但从地黄中提取 多糖成分进行降血糖作用研究,国内外尚未见报道,这对于地 黄的进一步开发利用具有重大意义,也有利于推动糖生物学 的深入研究。 为此,本文对地黄多糖的提取与纯化的方法进行研究,并 对地黄多糖对糖尿病小鼠降糖作用进行探讨。以期为地黄的 开发及其综合利用提供理论参考。 1仪器与材料 1.1材料试验药材:将采自河南怀庆的新鲜地黄药材浸入 ?30? 黄酒,酒液没过药面.用小火蒸千药液后,取出晒干制得。将 地黄在80℃烘箱中干燥至恒重,粉碎过20目筛。置干燥中备 用。试验动物:健康ICR小鼠,雌雄各半,体重在259309, 由徐州医学院动物实验中心提供。小鼠分笼饲养,置安静、避 强光、洁净、室温20℃-25℃、相对湿度60%-65%的环境中 喂普通鼠饲料,自由饮水,进食。通风良好。 1.2试剂阿卡波糖(:ltl京拜耳医药保健有限公司产品.国 药准字。19990205。临用前用0.2%的羧甲基纤维素钠配成含 阿卡波糖lmg?mL-1的混悬液);四氧嘧啶(美国sigma化学 公司产品。临用前用0.9%生理盐水配成1%四氧嘧啶溶液); 血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和极低密度脂蛋白胆固 醇(VLDL—c)、血糖(GLu)测定试剂盒均由四川省迈克科技有 限责任公司提供。乙醇、苯酚、石油醚、丙酮、正丁醇、浓硫酸、 氯化钠、乙醚、氢氧化钠等均为市售分析纯。 1.3仪器Uv.probe紫外分光光度计(日本岛津);Shi. maduFTIR8300红外光谱仪(日本岛津);BSZ.自动部分收集 器(上海沪西分析仪器厂);电热恒温干燥箱(江苏金坛亿通电 子有限公司);层析柱(1.6X20cm)(上海锦华实验仪器厂); 旋转蒸发仪(日本东京理化EYELA);PB203一N电子分析天平 (瑞士梅特勒.托利多仪器有限公司);722S分光光度计(上海 精密科学仪器有限公司);TMS-10241024i全自动生化分析仪 (日本东京医疗)。 2方法 2.1地黄多糖的提取分离 2.1.1地黄粗多糖的提取:取一定量的地黄依次用石油醚、 乙醚除去脂溶性杂质,然后用80%的乙醇脱单糖、低聚糖。 加10倍量的水90~100℃提取3次。3h/次,合并水提液,过 滤。70℃水浴减压浓缩至适量,加入5倍量95%的乙醇纯 析.静置过夜。离心过滤,置真空冷冻干燥得地黄多糖粗品。 2.1.2地黄粗多糖的纯化:将地黄粗多糖溶于蒸馏水,去不 溶物。按Sevag法(氯仿:正丁醇=4:1)脱蛋白.重复10次以 上。然后移至透析袋中用去离子水逆流透析24h。直至紫外光 谱分析检测无蛋白吸收。以氨水调节pH为8,滴加H202 50℃保温脱色2h,减压浓缩,加入5倍量的无水乙醇,静置过 万方数据 换页 StraitPharmaceuticalJournalVol22No.92010 夜,离心收集沉淀。将沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚漂洗2 次,冷冻干燥得去蛋白地黄粗多糖纯品。 2.1.3紫外光谱分析:取地黄粗多糖纯品适量,加水溶解。配 制成浓度为1.0g?L-1的多糖水溶液,采用紫外可见分光光 度法190—700nm范围内扫描。 2.1.4对照品溶液的制备:精密称取干燥至恒重的无水葡萄 糖对照品,用蒸馏水溶解后定容,配成浓度为116pg?mL1的 对照品溶液。 2.1.5供试品溶液的制备:精密称取上述提取得到的去蛋白 地黄粗多糖纯品0.5g。用蒸馏水溶解,稀释至刻度,制成浓度 为lOOgg?mL-1的供试品溶液。 2.1.6标准曲线的制备:根据苯酚一浓硫酸比色法【4】多糖被 浓硫酸水合时产生的高温迅速水解生成单糖。该单糖在强酸 的条件下,与苯酚反应生橙色衍生物。此橙色衍生物在490nm 处有最大吸收峰,其吸光度与浓度成线形关系。从而确定本研 究的最大吸收峰为490nm。精密吸取对照品溶液0.1、0.2、 0.4,0.6、0.8、1.0mL。分别置10mL具塞试管中,分别加蒸馏 水至2.0mL,再各加苯酚试液1.0mL.摇匀,迅速滴加浓硫酸 5.0mL,摇匀后放置5min,置沸水浴中加热15min,取出冷却 至室温;另取蒸馏水2mL。加苯酚和硫酸,同上操作为空白对 照。将上述溶液490nm处测定吸光度。 2.2地黄多糖降血糖作用的研究方法 2.2.1糖尿病动物模型建立(5-73:试验动物普通饲喂一周。 试验小鼠先禁食12h,正常饮水,基础称重。一次性腹腔注射 1%四氧嘧啶300mg?kg_‘,72h后,眼眶静脉丛采血。测空腹 12h血糖,选择血糖值大于15mmol?L-1的小鼠,确定为糖尿 病鼠。 2.2.2动物分组及处理:造模成功后,60只小鼠,随机分为 模型组、阿卡波糖治疗组(AR治疗组)、地黄粗多糖治疗组 (RGP治疗组),每组小鼠20只;同时选择20只正常小鼠设 为正常组。RGP治疗组从造模成功第二天开始灌胃,剂量为 300mg?(kg?d)。AR治疗组用20mg?(kg?d)阿卡波糖溶液灌 胃,正常组和模型组则每天灌胃同体积的生理盐水,试验中不 给与胰岛素和任何降血糖的药物。试验周期为4周。 2.2.3指标检测方法:①体重:试验期间每隔州称一次,每组 测定4周末的平均体重。②血糖(GLU)测定:造模成功后。于 灌胃各种受试物后4周末,每组小鼠眼眶静脉丛取血。分离血 清。按试剂盒说明书,采用全自动生化分析仪测定。③TC、 TG、VLDL-C的测定采用全自动生化分析仪测定。 2.3统计学方法所有计量资料采用均数±标准差表示(x ±s),统计处理先用F检验。再行q检验。配对资料采用配对 t检验。数据分析采用SPSSl3.0统计分析软件。P<0.05为 差异有统计学意义。 3结果 3.1地黄多糖的提取分离结果 3.1.1地黄多糖纯度的光谱分析结果:光谱显示地黄多糖具 有多糖特征性的紫外吸收图谱。仅在200nm处有一锐细吸收 峰,大于250am无明显的紫外吸收.是平坦的背景。结果表 明,提取纯化的多糖中不含有核酸、蛋白质以及其他杂质成 分。 3.1.2工作曲线回归方程的建立:经实验表明:葡萄糖的浓 度x和吸光度Y之间的线形回归方程为:Y=0.0056X+ 0.4361,相关系数R2=0.9995。得葡萄糖的标准曲线(见图 1)。葡萄糖标准溶液以苯酚一硫酸法测定时的最大吸收波长 在490nm处,故选择490nm作为地黄多糖的检测波长。 图1葡萄糖的标准曲线 3.1.3样品含量的测定:取供试品溶液在490nm测定吸光 度,计算地黄粗多糖的提取率和总糖平均含量,地黄粗多糖的 提取率为45.5%.总糖平均含量为35.2%。 3.2地黄多糖对血糖和血脂的影响实验结果 3.2.1地黄多糖xCd,鼠体重和血糖的影响:用药4周末。与正 常组相比,模型组体重降低、血糖升高,相比较有显著性差异 (P<o.05);AR治疗组、RGP治疗组与模型组相比.体重增加、 血糖降低,相比较有显著性差异(P<0.05)。结果(见表1)。 表l地黄多糖对糖尿病小鼠体重和血糖的影响fx±s-n=20) 删1丽丛‰丽—右产‰ 注:与正常组‘P<0.05;与模I宰|组比较’P<f.05 3.2.2地黄多糖对小鼠血清血脂水平的影响:模型组血清血 脂水平显著高于正常组(P<0.05)。可见糖尿病能引起血脂 紊乱。治疗后,AR治疗组、RGP治疗组与模型组比较。TG、 VLDL-C降低.相比较有显著性差异(P<0.05);治疗组与模 型组比较TC水平变化不大。差异无统计学意义(P>0.05)。 结果(见表2)。 4讨论 4.1地黄多糖含量测定方法的建立多糖总糖含量测定是 多糖提取分离的基础。一般依靠糖类物质的特征颜色反应进 行。就反应的化学过程而言。可以分为两类:①以无机酸(硫 酸或盐酸)使糖类脱水形成呋喃醛类衍生物,进一步与酚类或 含氮碱缩合生成有色物质;⑦以碱处理糖类,产生复杂的裂解 衍生物,与某些试剂相作用.呈现特殊颜色。目前常用的多糖 分析检测方法有:苯酚,硫酸、葸酮一硫酸和3,5一二硝基水杨酸 (简称DNS)法【4J。本实验选用苯酚.硫酸对地黄粗多糖总糖 含量进行测定。结果表明改进后的苯酚.硫酸显色后在 ?31? 万方数据 换页 海峡药学2010年第22卷第9期 490nm有最大吸收。本实验中通过对苯酚一硫酸法的方法学 考察,表明其方法可靠简便易行、快速灵敏、精密度高、显色稳 衰2地黄多糖对小鼠血清血脂水平的影响I;±s.mmol?L~.n=20} 定、重复性好、准确度好。可以作为地黄多糖含量测定的有效 方法。 组别 TGVLDL.CTC 治疗前治疗后治疗前 治疗后治疗前 治疗后 注:与正常组‘P<O.05;与模型组比较。P<O.05 4.2地黄多糖的分离纯化乙醇作为多糖常用的一种沉降 荆.其浓度与提取液的浓缩程度是影响沉降效果的关键因素。 醇析时乙醇浓度过低,溶液中的多糖不能完全沉淀出来,而乙 醇浓度过高会促使溶液中其他成分连同多糖一起析出,乙醇 浓度在75%~85%范围内较好.未经浓缩的多糖提取液由于 多糖含量较低。加入沉降剂后多糖浓度进一步下降,不利于多 糖沉淀。本文采用75%酒精沉淀得到的地黄粗多糖,经光谱 分析地黄粗多糖的提取率高,其总糖平均含量亦较高。地黄 多糖在空气中提取或干燥时颜色会加深,本研究中我们在地 黄多糖提取液除去色素的过程中用1%的活性炭。但在脱色 时活性炭使用量大。样品损失较多,后改为H2()2脱色除去色 素效果较理想,因此在地黄多糖提取液脱色以H202为佳。 本实验中,我们采用Sevage法脱除蛋白质的过程中,多糖损 失较大,这可能是由于地黄中的多糖主要以糖肽和糖蛋白的 形式存在。因此,应对地黄脱除蛋白的过程中为避免多糖的 损失而进一步研究。 4.3地黄多糖对糖尿病小鼠体重的影响本试验小鼠腹腔 注射四氧嘧啶后,血糖升高到15.94mmol?L~,出现了糖尿 病“三多一少”典型症状,说明糖尿病模型复制成功。四氧嘧 啶是一种p细胞毒剂,可选择地损伤小鼠的胰岛B细胞。造成 胰岛素分泌低下,从而导致血糖升高而引起试验性糖尿病【8】。 四氧嘧啶能选择性地破坏胰岛B细胞致使胰岛素分泌功能丧 失,造成内分泌功能紊乱。使糖、脂肪、蛋白质等代谢失调.而 代谢失调又进一步引起负氮平衡,使机体消瘦而体重下降【9】。 本试验结果表明,地黄多糖治疗组小鼠在治疗后体重显著上 升,与模型组小鼠体重相比显著升高(P<0.05).可见地黄多 糖能缓解糖尿病所致的体重降低。 4.4地黄多糖对糖尿病小鼠血糖及血脂的影响四氧嘧啶 诱导的糖尿病小鼠模型,在出现高糖血症的同时,会并发高脂 血症,其中甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇明显升高,血脂的 改变可能是高血糖并发的脂代谢紊乱所致,以高甘油三酯和 高低密度脂蛋白胆固醇为特征的脂代谢紊乱是糖尿病肾病的 重要高危因素“oj。糖代谢和脂代谢之间有着密切联系,高糖 ?32? 血症为原发性改变,高脂血症为继发性改变,因此纠正糖脂代 谢紊乱是治疗糖尿病及其并发症的重要手段(1l】。本试验研 究结果表明,地黄多糖能显著降低糖尿病小鼠的血糖值,至疗 程结束后,血糖值逐渐降低接近正常,同时甘油三酷和低密度 脂蛋白胆固醇明显降低。表明地黄多糖能够降低糖尿病小鼠 血糖水平,调节血脂紊乱,具有一定的调节糖脂代谢作用。其 作用机理可能是:地黄多糖对糖尿病小鼠胰岛8细胞有一定 的修复作用【12】,使胰岛素分泌增多从而改善糖代谢和脂代 谢。 参考文献 【1]刘福君,赵修南.聂伟.等.地黄低聚糖增强小鼠免疫功能的作用 【J].中国药理学学报。1998,14(1):90.94. 【2】中华医学会心血管病学分会.全国冠心病与糖尿病关系研讨会纪 要[J].中华心血管病.2004,32(2):183.184. 【3]陈力真,冯杏婉.周金黄,等.地黄多糖b的免疫抑瘤作用及其机 理【J).中国药理学与毒理学杂志。1993。7(2):153.156. 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