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大鼠脱细胞脊髓的形态学观察
关键字:观察,细胞,EF,GH,CD,AB,wx,yz,IJ,KL, 发布时间:2011-08-21

754 中国脊柱脊髓杂志2010年第20卷第9期ChineseJournalof印ineand却irudCord.2010,V01.20.M.9 大鼠脱细胞脊髓的形态学观察 李宏波1,李万里2,池永龙1,李玉丽3 (1温州医学院附属第二医院脊柱外科325027温州市;2浙江大学医学院附属第二医院骨科310009杭州市; 3温州医学院生物医学丁程研究院325027温州市) 【摘要】目的:观察大鼠脱细胞脊髓的形态特点.探讨其作为脊髓组织J二程支架的可行性。方法:取1l条SD大 鼠脊髓.采用冻融+化学萃取法进行脱细胞处理.其中2条采用HE染色观察脱细胞情况.立春红2R一亮绿SF 染色观察脱髓鞘情况;3条取颈、胸、腰段横切片行Malloryi色胶原染色和透射电镜检查,3条取颁、胸、腰段 纵切片行Malloryj色胶原染色.3条取颈、胸、腰段贴片行扫描电镜检查,观察其形态构成等参数,比较不问部 位材料内部结构的差异.结果:经脱细胞处理的脊髓呈乳白色扁长条状,十燥,体积较处理前略变小,韧性及强 度增加,表面脊膜包裹完好。无异味二HE染色显示脊髓内未见细胞残留;丽春红2R一亮绿SF染色证实神经细 胞轴突脱髓鞘完全。颈、胸及腰段脊髓横断面均呈网格状结构,纵断面均呈平行管状结构:颈、胸及腰段横断面 网格大小及纵断面平行管状结构I’HJ距行统计学两两比较,颈段网格长径明显大于胸段(P<0.05).胸段网格短径 明屁小于腰段(肚0.05)。其余均无统计学差异(P>0.05):结论:SD大鼠脊髓经脱细胞处理后颈、胸和腰段脱细 胞彻底,保留r原脊髓的主体结构,可作为脊髓组织下程的支架。 【关键词】脊髓损伤;组织丁程;脱细胞脊髓支架;大鼠 doi:10.3969/j.issn.1004--406X.2010.09.14 中图分类号:R318.5。R683.2文献标识码:A文章编号:1004铷6X(2010)一09—0754—05 Morphologystudyofdecellularizedratspinalcord/LlHongbo,LIWanli。CHIYonglongl,etal//Chinese JournalofSpineandSpinalCord,2010,20(9):754-758 【Abstract】Objective:Toobservatethemorphologyof ratdecellularizedspinalcordandtoinvestigatetheits feasibilityofworking asspinalcordtissueengineeringscaffolds.Method:ElevenSDratspinalcordsadopt wereprocessedbythemethodoffreeze-thawandchemicallyextractedforthepreparationofdecellularized anddemyelinatingspinalcordscaffoldmaterial.TwoscaffoldmaterialswereprocessedforHE stainingtoob— serveaeellularandPonceauRed2R——BrilliantGreenSFstainingtoobservedemyelinating.3cross-sectional specimensfromcervical.thoracicandlumbarsections werestainedbyMallorytrichromecollagenandobserved undertransmissionelectronmicroscope.3longitudinalspecimensfromcervical,thoracicandlumbarsections werestainedbyMallorytrichromecollagen,and3specimensfromcervical,thoracicandlumbarsectionswere observedundertransmissionelectronmicroscope.Theirmorphologyandinnerstructureofvariedsitewere,ob? servedandcompared.Result:Thedecellularizedspinalcord wascreamcoloranddisplayedfiatlongstrip.with thefeaturesofdry.slightlydecreasedvolumeandincreasedflexibilityandstrength。ithadcompletesuperficiM duramaterandnounusualsmell.HEstainingindicatednocellinthespinalcord;PonceauRed2R-Brilliant GreenSFstainingshowedcompletedemyelination.Cross-sectionspecimenpresentedwithgridstructureincer- vieal。thoracicandlumbarspinalcord.andlongitudinalspecimenpresentedwithparallel—tubestructure.The gridsizeandlongitudinaldistancebetweentheparalleltubeofcervical,thoracicandlumbarspecimen were comparedmutually.theresultsshowedlongerdiameterofcervical咖dthanthoracicones(P<0.05),andthe shortdiameteroflumbargridlargerthanthoracicogles(只=o.05).whilenosignificanceremainedfortherest. Conclusion:Afterrelativemanagement,spinalcordofcervical,thoracicandlumbarpresentwithcompletede- cellularization.themainstructureoftheoriginalspinalcordsareretained.whichisapttobeused够spinal cordtissueengineeringscaffold. 【Keywords】Spinalcordinjury;Tissueengineering;Decellularizedspinalcord;Rat 基金项目:浙汀省自然基金项日(编号:Y2080507)及浙江省卫生厅课题(编号:2007A140) 第一作者简介:男(1982一),在读硕上研究生.住院医师.研究方向:脊柱外科 电话:(0577)88879034E-mail:lihongb024@163.uom通讯作者:李万里E-mail:liwanli99@126.COlll 万方数据 换页 中同脊柱脊髓杂志2010年第20卷第9期 c^iMsP如Ⅱm耐∥却i船rwf却i加fco一.2010,Vd.20,Ⅳo.9755 【Author’sadd他鹤】DepartmentofSpineSu唱ery,SecondAmliatedHospital“WeTlzhouMedicalCollege, Wemhou。325027,Chi∞ 组织T程研究结果表明.生物支架材料及其 特定的形态结构对于损伤脊髓的修复效果具有至 关重要的作用…21。目前应用的组织工程支架材料 在物理性能、生物性能及形态结构上与正常脊髓 相比仍具有较大的差距,目前尚无与脊髓结构高 度相似且在理化性能也与脊髓相似的支架材料。 本研究采用郭树章等l,I的冻融+化学萃取法对大 鼠脊髓进行脱细胞处理。观察脱细胞脊髓的形态 特征.探讨不同节段的脱细胞脊髓材料能否作为 脊髓组织工程的支架。 l材料与方法 1.1实验动物和器材 SD大鼠(温州医学院动物实验中心),丽春红 2R、亮绿SF、脱氧胆酸钠(温州金山化学试剂有限 公司),脱氧核糖核酸酶(DNase)、核糖核酸酶 (RNase)(北京索莱宝科技有限公司),一80℃深低 温冰箱、恒温回旋振荡器及冷冻十燥机(温州医学 院附属第二医院中心实验室),扫描电镜、透射电 镜(温州医学院基础学院实验室)。 1.2脊髓脱细胞处理 11只2月龄雄性SD大鼠.重约200。2509. 每只用1.0~1.5“水合氯醛腹腔注射麻醉,背部 去毛,取后正中切口.打开椎板,显露并小心取出 脊髓。用PBS清洗去除表面血迹,参照郭树章等【31 方法对脊髓进行脱细胞处理:将脊髓置于一80℃深 低温冰箱中冻存lh。室温下解冻后置于蒸馏水 内.在室温下浸泡6h,每2h换液1次。然后置于 3%的脱氧胆酸钠盐蒸馏水溶液(加入适量lmoFL NaOH至溶液pH值为8-9),连续震荡4h(恒温回 旋振荡器内持续振荡,25℃,100dmin),再于蒸馏 水中浸泡振荡3h(震荡条件同前),lh换液1次, 置于IKU/“DNase和RNase混合液中持续振荡 30rain.在蒸馏水中浸泡3h.1h换液1次,自置于 脱氧胆酸钠盐蒸馏水溶液开始按上述操作再萃取 1遍。将萃取后的脊髓组织置于冷冻干燥机冻干。 环氧乙烷彻底消毒.一80℃冰箱保存。 1.3脱细胞脊髓的观察 1.3.1大体观察 观察脊髓的形状、大小、颜色。 表面情况。有无异味,韧性及硬度等。 1.3.2组织学检查随机选取2条脊髓,用10% 福尔马林液固定,常规石蜡包埋。其中1条随机选 取一部位行连续组织化学横切片.于另1条相应 部位行连续组织化学纵切片,片厚5¨m。每隔5 张切片取1张,共取5张切片。取横切片和纵切片 进行HE染色,光镜下观察脊髓脱细胞情况,细胞 胞核和胞质应分别呈蓝色和红色。。 立春红2R一亮绿SF染色:每隔5张切片取1 张,共取5张切片。取横切片和纵切片。用丽春红 2R染液(丽春红2R1.Og。冰醋酸2.5ml,蒸馏水 97.5m1)染色3-5rain。蒸馏水洗。1%磷钨酸水溶液 处理lmin后,亮绿SF染液(亮绿SF1.09,冰醋 酸lIIll,蒸馏水99m1)进行复染4rain,用1%冰醋 酸水溶液分化10s,蒸馏水洗,梯度酒精脱水,二 甲苯透明.中性树胶封固。光镜下观察脊髓脱神经 髓鞘情况.脊髓自质中神经纤维束轴索和髓鞘呈 橙红色,而灰质背景则呈淡绿色,神经元呈绿色。 1.3.3脱细胞脊髓不同部位内部结构比较剩余 9条脊髓用10%福尔马林液固定.常规石蜡包埋。 先取3条.分别在颈、胸及腰段行连续组织化学和 透射电镜横切片。于另外3条材料相应3个部位 分别行连续组织化学纵切片。组织化学切片片厚 5“m,透射电镜超薄切片片厚50nm。每条脊髓每 个部位每隔5张连续切片取l张,每种检测取5 张切片。组织化学横切片和纵切片行MalloDr三色 胶原染色:于0.5%酸性复红水溶液染色1rain,蒸 馏水漂洗后,染色l~2rain(苯胺蓝O.59、桔黄G 2.09、磷钨酸1.09、蒸馏水100“)。蒸馏水漂洗后, 95%酒精分色,梯度酒精脱水。二甲苯透明,中性 树胶封固.在光学显微镜下观察i段脊髓横断面 和纵断面的胶原保存情况及形态。透射电镜横切 片观察三段形态结构及测量网格孑L径大小。网格 孔径大小按图中标尺进行测量。再于剩余3条脊 髓相应3个部位用冻干折断法分别获得脊髓标本 的5个自然断面的贴片。每个部位取5个贴片,用 扫描电镜观察其形态构成,按图中标尺测量纵断 面平行管状结构间距。 1.4统计学处理 颈、胸、腰三段数据用平均数±标准差表示, 应用SPSS16.0统计学软件进行统计学分析,不 万方数据 换页 756 中国脊柱脊髓杂志2010年第20卷第9期ChineseJournalofspineandspinalCord.2010.V01.20。ⅣD.9 同部位均数的两两比较采用t检验.P≤0.05为有 统计学差异。 2结果 在脱细胞蒸馏水浸泡过程中可见大量白色絮 状物自脊髓内析出。脱细胞处理的脊髓经冷冻干 燥机冻干后呈乳白色扁长条状.干燥.体积较处理 前变小,韧性及强度略增加.表面仍由脊膜包裹。 无异味(图1)。在脱细胞处理后。脊髓切片HE染 色结果显示无细胞成分存在(图2);丽春红2R一 亮绿SF染色后,脊髓横、纵断面均呈蓝绿色背 景,无橙红色髓鞘成分(图3)。 Mallory三色胶原染色结果显示。脊髓颈、胸 及腰段横断面均呈网格状结构(图4),纵断面均 呈平行管状结构(图5)。超薄切片透射电镜检查 结果与Mallory三色胶原染色法基本相似。三段横 断面仍然为网格状结构(图6),扫描电镜结果显 示三段纵断面为平行管状结构(图7)。颈、胸和腰 段的网孔长、短径和平行管状结构间距见表1,颈 段网格长径与胸段比较有显著性差异(P<0.05), 胸段网格短径与腰段比较有显著性差异(P= 0.05)。颈段网格短径与胸段比较、胸段网格长径 与腰段比较及颈段网格长、短径与腰段比较均无 显著性差异(P>0.05),说明网格孑L径颈、腰段较 大,胸段较小。颈、胸和腰段纵断面平行管状结构 间距两两比较均无显著性差异(尸>0.05)。 3讨论 SCI的治疗是当今脊柱外科研究的难点和热 点领域之一。SCl分为原发性损伤和继发性损伤, 原发性损伤一旦发生不可避免,而继发性损伤在 一定干预下可减轻或者避免,因此阻止或减少继 发性损伤是治疗的关键。针对继发性损伤的发生 机制.目前治疗SCI的方法包括药物治疗、高压氧 图l大鼠脱细胞脊髓长3.04.Ocm,直径2.0—2.5ram;两 侧可见断裂神经根,尾部逐渐变细,并可见马尾结构 治疗、传统手术治疗等。虽然这些治疗方法均可取 得一定疗效.但却仍不令人满意。随着组织工程技 术的不断发展.采用组织工程方法治疗SCI显示 出令人欣喜的前景。组织工程要素有二,即支架和 种子细胞。支架应该符合一定的要求。SCI处植入 的支架应该提供一定立体结构.能为神经元及其 轴突以及复合的种子细胞生长提供限定的空间, 防止外界其他活性成分的干扰,指引神经元轴突 延伸,使新形成的组织接近于原有的解剖结构,有 利于功能性连接的建立。充填的支架材料还应该 能防止胶质瘢痕的形成.引导细胞及轴突生长形 成类似于正常解剖结构的组织.为中枢神经功能 恢复建立基础。如果单纯进行细胞移植治疗而没 有有效的支撑.细胞生长缺乏攀爬的支架,加之周 围胶质瘢痕的长入阻碍.神经轴突无法充分延伸 与周围正常组织形成突触。而应用组织工程治疗 能显著改善这一情况.并且示踪显示其新生的组 织与周围正常神经组织存在轴突连接I圳。无毒、不 引起细胞突变和不良组织反应.与脊髓结构性质 近似.组织相容性好.不引起排斥反应。在体内较 稳定.一段时间内能保持好的外形.是对组织工程 学中应用材料的基本要求。目前常用的可用于修 复SCI的材料主要有不可降解材料、可降解材料、 二者复合材料、纳米高分子材料以及生物材料的 结构形式等。虽然这些材料用于组织工程各有其 可取之处。由于脊髓组织本身在结构、功能上的特 殊性、复杂性,均未能很好地模仿脊髓组织,修复 效果也有限。组织工程研究表明细胞外基质不仅 对组织细胞具有支持作用15l。而且细胞外基质中 所含的胶原、蛋白多糖、黏附分子及细胞因子等成 分还可影响细胞形态,调控细胞的代谢、迁移、增 殖、分化及信息传递㈦7】。因此,采用适当形式的细 胞外支架材料有望改善细胞移植后的局部微环境 状态.从而对移植效果产生积极影响。脱细胞基质 即具有细胞外基质的上述作用。作为组织工程支 架具有与组织相似的结构,从而找到了一个解决 仿制脊髓组织结构困难的途径。脱细胞技术在周 围神经、皮肤、心肌、心瓣膜、膀胱等方面已得到了 广泛的应用并取得了较好的效果,技术已经相对 成熟。郭树章等在此基础上率先采用冻融+化学 萃取的方法制备了脱细胞脊髓支架,并经过验证 证实脱细胞脊髓支架具有与脊髓相似的结构.层 黏连蛋白、纤维连接蛋白等细胞外基质成分得到 万方数据 换页 中国脊柱脊髓杂志2010年第20卷第9期 ChineseJournalofspira,andspinalCord,2010,V01.20.No.9 757 保留Esl,脱细胞脊髓支架只引起轻微的免疫排斥 反应和炎症反应[91。尹文化等fjfw亦证实机械振荡有 利于清除脊髓内细胞、轴突和髓鞘,合适的机械振 荡频率在去细胞的同时.还能较好地保存脊髓内 天然的基质纤维和空间结构。 本研究按照郭树章等引的方法,成功制成了 脱细胞脊髓材料。通过HE染色、立春红2R一亮绿 SF染色证实脊髓脱细胞、脱髓鞘彻底。选用颈、 胸、腰=三段脊髓分别制成横、纵两个断面。采用 Mallory三色胶原染色、透射电镜及扫描电镜进行 图2 HE染色(x400)光镜观察两断面均未址蓝色胞核或者红色胞质等细 胞结构(a脊髓横断面b脊髓纵断面)图3丽春红2R一亮绿SF染色 ()<400)光镜观察:淡绿色缸示为脊髓灰质背景,未见应该被染成橙红色的 神经纤维柬轴索和髓鞘(a脊髓横断面b脊髓纵断面)图4应用 Malloryi色胶原染色(×400)显示细胞外基质即胶原纤维被染成蓝色,颈、 胸、腰i段脊髓横断面胶原纤维均未被破坏.形态保存.被染成蓝色.均呈 网孔状结构(a颈段脊髓横断面b胸段脊髓横断面c腰段脊髓横断 面)图5 Mallory=三色胶原染色(×400)硅爪颈,胸、腰■段脊髓纵断【白i被 染成蓝色。形态均呈平行管状结构(a颈段脊髓纵断面b胸段脊髓纵断 面c腰段脊髓纵断面) 万方数据 换页 758 中国脊柱脊髓杂志2010年第20卷第9期 Chinese如arnd矿却ineand却iradCord,2010.y“.20.No.9 图6超薄切片透射电镜检查显示颈、胸、腰i段脊髓横断面均早网孔状结构,未见细胞结构(a颈段横断面b胸段横断 面c腰段横断面)(x700)图7扫描电镜显爪颈、胸、腰三段脊髓纵断面形态均呈平行管状结构,未见细胞结构(a颈 段纵断面b胸段纵断面c腰段纵断面)(x1000) 表I脱细胞脊髓颈、胸、腰段横断面网孔与纵断面平 行管状结构参数 (;虹。斗m,n=5) 往:①与颈段比较2<0.05。②‘j胸段比较P=-O.05 比较,结果证实三段脊髓横断面均呈网孔状结构. 纵断面均呈平行管状结构。同时统计学处理结果 显示颈、腰段脊髓孑L径与胸段脊髓孔径有差别. 颈、腰段脊髓孑L径较大.而胸段脊髓孔径最小。在 解剖上,正常脊髓有两个膨大。即颈膨大和腰骶膨 大.呈现两端粗中间细的大体形态.这可能是脊髓 孔径颈、腰段较大而胸段较小的一个解剖学原因。 综上所述,颈、胸、腰i段脊髓均可用于SCI修复, 但在脊髓组织T程中,材料孔径的大小是否对种 子细胞的局部增殖、神经元及轴突的再生产生影 响有待于进一步探讨。 4参考文献 1.SaehlosE.ReisN,AinsleyC,eta1.Novelcollagenscaffolds withpredefinedinternalmorphology.madebysolidfreeform fabrication[J].Biomaterials.2003.24(8):1487-1497. 2.HenchLL,PolakJM.Third-generationbiomedicalmaterials[J]. Science。2002,295(5557):1014—1017. 3.郭树章.任先军,蒋涛,等.脱细胞脊髓天然支架的制备及形态 学观察【JJ.中国矫形外科杂志,2007,15(3):225—228. 4.ChengH.HuangYC。ChangPT。eta1.Laminin-incorporated nervecomluitsmadebyplasmatreatmentforrepairingspinal cordinjury【J】.BiochemBiophysResCommun。2007,357(4): 938—944. 5.O’ConnorSM,StengerDA,ShafferKM,eta1.Primaryneural precursorcellexpansion,differentiationandeytosolicCa“re— sponse inthree—dimensionalcollagengel【J1.jNeuroseiMet hods,2000,102(2):187—195. 6.MaW,FitzgeraldW.O’ShaushnessyTJ,eta1.CNSstemand progenitorcelldifferentiationintofunctional.neuronalcircuits inlherP—djmPnsjonalcollagengels【J】.JExpNeurol,2004,190 (2):276—288. 7.MurakamiT,FujimotoY,YasunagaY,eta1.Transplantedneu— renalprogenitorcellsinaperipheralHelve gappromote nerve repair[J].BrainRes.2003.974(1-2):17—24. 8.郭树章,任先军,蒋涛,等.脱细胞脊髓支架的成分分析【J】.第二 军医大学学报.2007.29(13):1313一1315. 9.郭树章。任先军.蒋涛。等大鼠脱细胞异体脊髓支架的免疫原 性研究【J】.巾围矫形外科杂志.2007.15(6):444-446. 10.尹文化.金大地,邓许勇,等.机械振荡对脊髓去细胞支架形 态学的影响IJI.南方仄科大学学报,2008,28(10):1748一1751. (收稿U期:2010—05—24修回n期:2010-07一OI) (英文编审 蒋 欣,郭万首) (本文编辑李伟霞) 万方数据 换页

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